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Biochemistry

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

화학 및 바이오 컨쥬게이션 기술은 최근 몇 년 동안 급속히 개발되어 단백질 폴리머의 구축을 허용하고 있습니다. 그러나, 제어 된 단백질 중합 과정은 항상 도전이다. 여기에서, 우리는 합리적으로 통제된 순서에 있는 단계별로 중합된 단백질을 건설하기 위한 효소 방법론을 개발했습니다. 이 방법에서, 단백질 단면제의 C-말단은 OaAEP1(Oldenlandiaaffinis asparaginis asparaginyl endopeptidases)을사용하여 단백질 컨쥬게이션을 위한 NGL인 반면, N-말단은 클레이브 가능한 TEV(담배 에칭 바이러스) 분열 부위와 L(ENLYFQ/GL)을 임시 N-단말 보호를 위한 것이다. 결과적으로, OaAEP1은 한 번에 하나의 단백질 단량체만 을 첨가할 수 있었고, 그 후 TEV 프로테아제는Nh 2-Gly-Leu를 노출시키기 위해 Q와 G 사이의 N-종단을 갈라졌다. 그런 다음 장치는 다음 OaAEP1 결찰에 대한 준비가 됩니다. 엔지니어링 된 다단백질은 원자력 현미경 검사법 기반 단일 분자 힘 분광학 (AFM-SMFS)을 사용하여 개별 단백질 도메인을 전개하여 검사됩니다. 따라서, 이 연구는 다단백질 공학 및 고정화를 위한 유용한 전략을 제공한다.

Introduction

합성 중합체에 비해, 천연 다중 도메인 단백질은 잘 제어 된 수와 하위 도메인1의유형과 균일 한 구조를 갖는다. 이 기능은 일반적으로 향상된 생물학적 기능 및 안정성2,3을이끈다. 시스테인 계이황화 결합 결합 및 재조합 DNA 기술과 같은 많은 접근법은, 다중 도메인4,5,6,7과같은 중합 단백질을 구축하기 위해 개발되었다. 그러나, 전자 방법은 항상 무작위 및 통제되지 않는 서열을 초래하고, 후자의 방법은 독성 및 대형 단백질의 과발현어려움 및 보조 인자 및 기타 섬세한 효소로 복잡한 단백질의 정제를 포함한 다른 문제를 초래한다.

이러한 과제를 충족시키기 위해, 우리는 프로테아제 TEV8,9와결합된 단백질 리가세 OaAEP1을 사용하여 단계적으로 폴리머/폴리단백질에 대한 단백질 단량체를 결합하는 효소 방법을 개발합니다. OaAEP1은 엄격하 고 효율적인 엔도 펩 티 다아제. 2개의 단백질은 N-종단이 글리-루 잔기(GL)이고 다른 하나는 C-종단이 NGL 잔기10인경우 30분 이내에 OaAEP1에 의해 2개의 테르미니를 통해 Asn-Gly-Leu 서열(NGL)으로 공유적으로 연결될 수 있다. 그러나, OaAEP1의 사용은 단백질 단량체를 연결하는 것만이 시스테인 계 커플링 방법과 같은 조절되지 않은 서열을 가진 단백질 중합체로 이끈다. 따라서, 우리는 ENLYFQ/G-L-POI로 착유류 잔류물을 더한 탈착식 TEV 프로테아제 부위를 가진 단백질 단위의 N-종단을 디자인합니다. TEV 분열 전에, N-단말은 OaAEP1 결찰에 참여하지 않을 것이다. 그리고 추가 OaAEP1 결찰과 호환되는 N-종점의 GL 잔기는 TEV 절단 후에 노출됩니다. 따라서, 우리는 비교적 잘 조절된 서열을 가진 다단백질의 순차적 효소 생합성 방법을 달성하였다.

여기서, 우리의 단계적 효소 합성 방법은 서열 조절 및 조절되지 않는, 단일 분자 연구를 위한 단백질 고정화를 포함하여 다단백질 샘플 준비에 사용될 수 있으며, 특히 같은 복잡한 시스템에 대해서도 금속 단백질.

더욱이, AFM 기반 SMFS 실험을 통해 단일 분자 수준에서 단백질 중합체 구조 및 안정성을 확인할 수 있습니다. AFM, 광학 핀계 및 자기 트위저를 포함한 단일 분자 힘 분광법은 생체 분자를 기계적으로 조작하고 안정성을 측정하는 나노 기술의 일반적인 도구입니다11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. 단 하나 분자 AFM은 단백질 (un)접이식21,22,23,24,25,수용체 -리간드 상호 작용26,27,28,29,30,31,32,33,34, 34의연구에 널리 사용되어 왔다. 35,무기 화학 결합20,36,37,38,39,40,41 ,42,43 및 금속 리간드 결합 금속 단백질44,45,46,47,48,49,50 . 여기서, 단일 분자 AFM은 상응하는 단백질 전개 신호에 기초하여 합성된 다단백질 서열을 검증하는데 사용된다.

Protocol

1. 단백질 생산 유전자 클론 관심 있는 단백질(POI)을 코딩하는 유전자를 구매하는 유전자: 유비퀴틴, 루브루독신(RD)51,셀룰로오스 결합 모듈(CBM), 도커린-X 도메인(XDoc) 및 루미노크코커스 플라베파시에서응집성,담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELPs). 중합효소 연쇄 반응을 수행하고 상이한 단백질 단편으로?…

Representative Results

OaAEP1 결찰에 의해 인접한 단백질 사이에 도입된 NGL 잔기는 전개력(&F u>)및 윤곽 길이 증분(&ΔL c>)으로서 중합체의 단백질 단량체 안정성에 영향을 미치지 않을 것이며()는 이전 연구와 비교할 수 있다(그림1). 루브레독신 단백질의 정제 결과는 도 2에나타내고 있다. TEV 절단 후 단백질을 증명하기 위해 제어 서열과 함께 단백질 중합?…

Discussion

우리는 효소 생합성 및 다단백질의 고정화를 위한 프로토콜을 기술하고 AFM 기지를 둔 SMFS에 의하여 polyprotein 디자인을 확인했습니다. 이 방법론은 폴리 단백질 공학 및 고정4,6,52,53,54,55,56,57,<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 21771103, 21977047), 장쑤성 자연 과학 재단 (그랜트 번호) . BK20160639) 및 장쑤성 황추앙 프로그램.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
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References

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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
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