פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי
Summary
מוצג כאן הוא שיטה יעילה ובטוחה כדי להדביק הזחלים דג זברה עם התווית fluorescently באופן אנאירובי C. הקושי על ידי הזרקת microinjection ו פולשני.
Abstract
Clostridioides קושי זיהום (cdi) נחשב לאחד מזיהומים במערכת העיכול הנפוצים ביותר הקשורים לבריאות בארצות הברית. התגובה החיסונית מולדת נגד הקושי המתואר כבר תוארה, אבל התפקידים המדויקים של נויטרופילים ו מקרופאגים ב-cdi הם פחות מובנים. במחקר הנוכחי, הזחלים danio rerio (zebrafish) משמשים כדי להקים C. בקושי מודל זיהום לדימות התנהגות ושיתוף פעולה של תאים אלה מולדים החיסונית ב vivo. כדי לפקח על C. הקושי, פרוטוקול תיוג באמצעות צבע פלורסנט הוקמה. זיהום המותאם לשפות אחרות מושגת על ידי מיקרוהזרקת מתויג C. הקשיים, אשר באופן פעיל גדל במערכת העיכול דג זברה ומחקה את הנזק האפיתל המעי cdi. עם זאת, פרוטוקול זה זיהום ישיר הוא פולשני וגורם פצעים מיקרוסקופיים, אשר יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוני. מכאן, פרוטוקול microgavage שאינו פולשני יותר מתואר כאן. השיטה כרוכה במסירה של C. הקושי תאים ישירות לתוך המעיים של הזחלים דג זברה ידי צנרור דרך הפה הפתוח. זו שיטת הדלקת מחקה היטב את תוואי זיהום טבעי של C. הקושי.
Introduction
ג. הקושי הוא גרם-חיובי, נבג-יוצר, אנאירובי, ו-הרעלן מייצר באקלוס כי הוא הגורם המוביל של זיהומים חמורים במערכת העיכול1. תסמינים טיפוסיים של cdi כוללים שלשול, כאבי בטן, קוליטיס הפסבדו מכרעת, וזה יכול לפעמים להוביל למוות1,2. ראיות הראו כי מארח התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי הן התקדמות ותוצאה של מחלה זו3. בנוסף לתגובה החיסונית, מיקרוביוטה הבטן הילידית היא חיונית לתחילתה ופתוגנזה של CDI4. בעשור האחרון, הן מספר המקרים ואת שיעור התמותה של cdi גדלו באופן משמעותי בשל הופעתה של זן היפרשני של C. הקושי (BI/NAP1/027)5,6. הבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון הבסיסיים ואת התפקיד של microbiota במהלך CDI יסייע להוביל התפתחויות טיפוליות חדשות והתקדמות, המאפשר שליטה טובה יותר של מגיפה זו.
כמה מודלים בעלי חיים, כגון אוגר ועכבר, פותחו כדי לספק תובנה ההגנה החיסונית נגד C. הקושי7,8. עם זאת, התפקיד של תאים חיסוניים מולדים עדיין מובנת בצורה גרועה, במיוחד מאז התנהגות מולדת התא החיסונית נגזרת בעיקר מניתוח היסטולוגית או מתאים בתרבית מבחנה. לכן, הקמת מודל שקוף דג זברה כדי לחשוף את התגובה החיסונית מולדת C. הקושי בתוך האורגניזם בעלי חוליות חיים יקל על מחקרים כאלה. הזחלים zebrafish יש מערכת חיסונית תפקודית מולדת, אבל הם חסרים את המערכת החיסונית אדפטיבית עד 4 – 6 שבועות לאחר הפריה9. תכונה ייחודית זו עושה הזחלים דג זברה מודל מעולה ללמוד את התגובה המבודדת ותפקוד של תאים חיסוניים מולדים ב-cdi.
דו ח זה מתאר שיטות חדשות באמצעות הזחלים דג זברה ללמוד את האינטראקציות בין C. הקושי ואת התאים החיסוניים הטבועה, כגון מקרופאגים ו נויטרופילים. תחילה, מוצג פרוטוקול מיקרוהזרקת מקומי הכולל C. הקשיים וההכתמים. שימוש vivo קונפוקלית וקד זמן לשגות הדמיה, התגובה של נויטרופילים ו מקרופאגים לקראת האתר זיהום מוקלט, ואת phagocyציטוזה של חיידקים על ידי נויטרופילים מקרופאגים הוא נצפתה. עם זאת, דווח כי ההזרקה עצמה גורמת נזק לרקמות מוביל גיוס של לוקיציטים עצמאית של חיידקים10. לכן, פרוטוקול microgavage לא פולשני לספק C. הקושי לתוך המעיים של הזחלים דג זברה מתואר לאחר מכן. מחקרים קודמים הוכיחו כי מיקרוביוטה מערכת העיכול הילידים להגן על מארח נגד הקולוניזציה של C. הקושי11. לכן, הזחלים גנוטוביוטיים משמשים גם כדי להיפטר הדגים הנגועים 12. לאחר מכן, ניתוח מעיים מבוצע כדי לשחזר את קיימא C. הקושי ולאמת את משך הנוכחות שלהם בתוך מעיים של דגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המוצגות לשנות ולהרחיב גישה קיימת כדי להדביק את הזחלים דג זברה על ידי ביצוע שתי הזרקה ו microgavage10,14. זה גם מדגים גישה לחקור פתוגנים אנאירובית עם הזחלים דג זברה22. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ניתוח של תגובות תא החיסון הטבוע בvivo על CDI ועל הקולוניזציה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לטימו פריטש. לטיפול מעולה בחיות אנו מודים לחברי מעבדות הקוסטר והסטירטי לתמיכה ולדיונים מועילים. אנו מודים לד ר דנדאן האן על כך. שקריטי לקרוא את כתב היד אנו מודים בהכרת תודה על ידי המדינה הפדרלית של סקסוניה התחתונה, נינידזצ ווראב (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
