Presenteras här är en säker och effektiv metod för att infektera zebrafisk larver med fluorescerande märkt anaeroba C. difficile genom mikroinjektion och noninvasive microgavage.
Clostridioides difficile infektion (CDI) anses vara en av de vanligaste hälso-associerade gastrointestinala infektioner i USA. Det medfödda immunsvaret mot C. difficile har beskrivits, men de exakta rollerna för neutrofiler och makrofager i CDI är mindre förstådda. I den aktuella studien används Danio rerio (zebrafisk) larver för att upprätta en C. difficile infektionsmodell för att avbilda beteendet och samarbetet hos dessa medfödda immunceller in vivo. För att övervaka C. difficilehar ett märkningsprotokoll med ett fluorescerande färgämne upprättats. En lokaliserad infektion uppnås genom microinjecting märkt C. difficile, som aktivt växer i zebrafisk tarmkanalen och härmar tarmepitelskador i CDI. Detta direkta infektionsprotokoll är dock invasivt och orsakar mikroskopiska sår, vilket kan påverka experimentella resultat. Därför beskrivs ett mer noninvasive microgavage-protokoll här. Metoden innebär leverans av C. difficile celler direkt i tarmen av zebrafisk larver genom intubation genom den öppna munnen. Denna infektion metod nära härmar den naturliga infektionen vägen av C. difficile.
C. difficile är ett gram-positiv, spore-bildande, anaeroba, och toxinproducerande bacillus som är den främsta orsaken till allvarliga infektioner i mag-tarmkanalen1. Typiska symtom på CDI inkluderar diarré, buksmärta, och dödlig pseudomembranous kolit, och det kan ibland leda till döden1,2. Bevis har visat att värd immunsvar spelar en avgörande roll i både progression och resultatet av denna sjukdom3. Förutom immunsvaret är den inhemska tarmmikrobiota avgörande för uppkomsten och patogenesen vid CDI4. Under det senaste årtiondet har både antalet fall och dödligheten i CDI ökat avsevärt på grund av uppkomsten av en hypervirulent stam av C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bättre förståelse av underliggande immunmekanismer och mikrobiotas roll under CDI kommer att bidra till att leda till ny terapeutisk utveckling och framsteg, vilket möjliggör bättre kontroll av denna epidemi.
Flera djurmodeller, såsom hamster och mus, har utvecklats för att ge insikt i immunförsvaret mot C. difficile7,8. Emellertid, rollen av medfödda immunceller är fortfarande dåligt förstås, särskilt eftersom medfödda immuncell beteende beror främst från histologisk analys eller odlade celler in vitro. Därför kommer upprättandet av en transparent zebrafisk modell för att avslöja det medfödda immunsvaret mot C. difficile inuti en levande ryggradsdjur organism underlätta sådana studier. Zebrafisk larver har ett funktionellt medfött immunförsvar, men de saknar adaptivt immunförsvar fram till 4-6 veckor efterbefruktning9. Denna unika funktion gör zebrafisklarver till en utmärkt modell för att studera det isolerade svaret och funktionen hos medfödda immunceller i CDI.
Denna rapport beskriver nya metoder med zebrafisk larver för att studera interaktioner mellan C. difficile och medfödda immunceller, såsom makrofager och neutrofiler. Först presenteras ett lokaliserat mikroinjektionsprotokoll som inkluderar C. difficile inoculum och färgning. Med hjälp av in vivo confocal time-lapse imaging, svaret från neutrofiler och makrofager mot infektionsstället registreras, och fagocytos av bakterier av neutrofiler och makrofager observeras. Det har dock rapporterats att själva injektionen orsakar vävnadsskador och leder till rekrytering av leukocyter oberoende av bakterierna10. Därför beskrivs därefter ett noninvasive microgavage-protokoll för att leverera C. difficile i zebrafisklarvernas tarm. Tidigare studier har visat att inhemska gastrointestinala mikrobiota skydda en värd mot kolonisering av C. difficile11. Därför används gnotobiotiska zebrafisklarver också för att predisponera zebrafisken som är infekterade 12. Därefter utförs tarmdissektion för att återställa livskraftig a. difficile och validera varaktigheten av deras närvaro i zebrafisk tarmkanalen.
De presenterade metoderna ändrar och utökar en befintlig metod för att infektera zebrafisklarver genom att utföra både injektion och mikrogavage10,14. Det visar också en metod för att studera anaeroba patogener med zebrafisk larver22. Dessutom underlättar protokollet analysen av medfödda immuncellsvar in vivo på CDI och vid kolonisering av C. difficile i zebrafisk. Metoden är reproducerbar och lätt att genomföra i ett…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Timo Fritsch för utmärkt djurvård. Vi tackar medlemmarna i Köster och Steinert labs för stöd och hjälpsamma diskussioner. Vi tackar dr Dandan Han för att han läste manuskriptet. Vi erkänner tacksamt finansiering av den federala staten Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
FIJI | open-source platform | Image processing | |
HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Yeast extract | BD Bacto | 212750 |