נוק-דאון מותנה משולב ואסא היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד גן הקשורים לגזע של תאי גזע נגזר סרטן הקיבה נגזר
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.
Abstract
תאי גזע סרטניים (CSCs) מעורבים חניכה גידול, התפתחות והישנות לאחר הטיפול, והפכו למרכז תשומת הלב של מחקרים רבים בעשורים האחרונים. לכן, חשוב לפתח שיטות לחקור את התפקיד של גנים מרכזיים המעורבים גזע תאים סרטניים. סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר של סרטן. תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) נחשבים השורש של נסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. הבנת ביולוגיה GCSCs נדרש כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים ממוקדים ובסופו של דבר כדי להפחית את התמותה בקרב חולים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.
Introduction
סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר ומוות של סרטן1. למרות ההתקדמות בניתוח משולב, כימותרפיה והקרנות בטיפול GC, הפרוגנוזה נשארת עניה שיעור ההישרדות של חמש שנים הוא עדיין נמוך מאוד2. הישנות וגרורות הן הסיבות העיקריות לגרום למוות שלאחר הטיפול.
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת קבוצה של תאים סרטניים בעלי היכולת לחדש את עצמו וליצור את תריסות התא השונות לשחזר את הגידול3. CSCs הם האמינו להיות אחראי על נסיגה סרטן גרורות בשל היכולות שלהם של התחדשות עצמית ותזיטת גידולים חדשים, כמו גם ההתנגדות שלהם כימותרפיה מסורתית- ורדיותרפיות4. לכן, מיקוד CSCs וחיסול של CSCs לספק פוטנציאל מרגש כדי לשפר את הטיפול ולהפחית את התמותה של חולי סרטן.
CSCs כבר מבודדים מסוגים רבים של גידולים מוצקים5. בשנת 2009, תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) מבודדים קווי תאים סרטניים קיבה אנושיים תוארו במקור על ידי Takaishi ואח‘6. חן ועמיתיו זיהו לראשונה ומטוהרים GCSCs מ אדנוקרצינומה קיבה אנושית (GAC) רקמות גידול7. ממצאים אלה לא רק מספקים הזדמנות ללמוד ביולוגיה GCSCs, אלא גם לספק חשיבות קלינית רבה.
מאפיין מסוים של CSCs הוא היכולת שלהם ליצור כדור8. תאים בודדים מצופה בתנאים לא דביקים בצפיפות נמוכה, ורק התאים בעלי התחדשות עצמית יכולים לגדול לתוך אשכול מוצק וכורי הנקרא כדור. לכן, ההתווייה של היווצרות הכדור נחשבה ל-assay תקן הזהב ונעשה בה שימוש נרחב להערכת פוטנציאל החידוש העצמי של תאי גזע במבחנה.
הפרעות RNA (RNAi) הוא כלי מחקר רב עוצמה כדי ללמוד את תפקוד הגנים על ידי נוק-דאון של גן מסוים9. עם זאת, טכנולוגיות נוק-דאון גנים יציבים לטווח ארוך יש מגבלות מסוימות, כגון האתגר של חקר הפונקציה של גן חיוני להישרדות תאים. מערכות RNAi מותנות יכולות להיות שימושיות לרישום של הגנים הרצויים באופן זמני ו/או מבוקר מיוחד על ידי ניהול של סוכן גורם. מערכות טטרציקלין (Tet)-inducible הן אחת ממערכות RNAi המותנות הנפוצות ביותר10. מערכות Tet-inducible יכול לגרום השתקת גנים היעד על ידי שליטה הביטוי של shRNA בתוספת של גורם אקסוגני (דוקסיציקלין עדיף, דוקס). ניתן לחלק את מערכות Tet-inducible לשני סוגים: מערכות Tet-On או Tet-Off. ניתן להדליק את הביטוי shRNA (Tet-On) או לכבות (Tet-Off) בנוכחות ה-inducer. במערכת Tet-ON ללא גורם, המדכא Tet (TetR) התבטא באופן קבוע כקושר לרצף הרכיב המגיב של Tet (TRE) המכיל יחצ”ן התלוי ב-Tet Pol III לביטוי shRNA, ובכך מדחיק את הביטוי של shRNA. בעוד עם תוספת של Dox, TetR מבודד מן היזם המגיב Tet Pol III תלוי. זה מקל על הביטוי של shRNA ומוביל לחיסול גנים.
הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מערכת shRNA טטרציקלין-בלתי ניתן להושר ומערכת היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את הפונקציה של clusterin ב GCSCs נגזר המטופל. Clusterin זוהה כמוקולת מפתח רומן לשמירה על הגזע והישרדות של GCSCsבמחקר קודם 11. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי ללמוד את ההשפעות של clusterin ב-GCSCs התחדשות עצמית. מתודולוגיה זו ישימה גם על סוגים אחרים של תאי גזע סרטניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC הוא הגורם המוביל השלישי למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם. GCSCs הם קריטיים בנסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. באמצעות GCSCs מחולים בסרטן הקיבה יאפשר לנו לחקור את נקודת התורפה שלהם ולפתח את תרופות מיקוד לטיפול של חולי GC.
היווצרות כדור assay היא שיטה שימושית כדי לבחון את פוטנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2018A030310586, 2020A1515010989), הקרן למחקר מדעי רפואי של מחוז גואנגדונג (A2019405), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81772957), המדע והתוכנית הטכנולוגית של מחוז גואנגדונג בסין (2017B030301016), והקרן לתעשייה וטכנולוגיה מידע של שנג’ן (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
