संयुक्त सशर्त नॉकडाउन और अनुकूलित क्षेत्र गठन परख रोगी व्युत्पन्न गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल के एक स्टेमनेस-संबद्ध जीन का अध्ययन करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी-व्युत्पन्न जीसीएस के स्टेमनेस पर क्लस्टरिन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सशर्त नॉकडाउन प्रणाली और एक अनुकूलित क्षेत्र गठन परख का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के सीएससी में स्टेमनेस से जुड़े जीन के इन विट्रो और वीवो फंक्शन दोनों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
कैंसर स्टेम सेल (CSCs) ट्यूमर दीक्षा, विकास और उपचार के बाद पुनरावृत्ति में फंसाया जाता है, और पिछले दशकों में कई अध्ययनों के ध्यान का केंद्र बन गए हैं । इसलिए, कैंसर सेल स्टेमनेस में शामिल प्रमुख जीन की भूमिका की जांच करने के तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है। गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कैंसर के सबसे आम और नश्वर प्रकार में से एक है। गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल (जीसीएससी) को गैस्ट्रिक कैंसर रिलेप्स, मेटास्टेसिस और ड्रग रेजिस्टेंस की जड़ माना जाता है । लक्षित उपचारों के विकास को आगे बढ़ाने और अंततः रोगियों के बीच मृत्यु दर को कम करने के लिए जीसीएस जीव विज्ञान को समझना आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी-व्युत्पन्न जीसीएस के स्टेमनेस पर क्लस्टरिन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सशर्त नॉकडाउन प्रणाली और एक अनुकूलित क्षेत्र गठन परख का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के सीएससी में स्टेमनेस से जुड़े जीन के इन विट्रो और वीवो फंक्शन दोनों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कैंसर के सबसे आम और नश्वर प्रकार में से एक है1। संयुक्त सर्जरी, कीमोथेरेपी और जीसी थेरेपी में रेडियोथेरेपी में प्रगति के बावजूद, रोग का निदान गरीब रहता है और पांच साल के जीवित रहने की दर अभी भी बहुत कमहै 2। ऑड-ईवन और मेटास्टेसिस उपचार के बाद होने वाली मौतों का मुख्य कारण है।
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) कैंसर कोशिकाओं का एक सबसेट है जो ट्यूमर3का पुनर्गठन करने वाले विभिन्न सेल वंश को आत्म-नवीनीकृत करने और उत्पन्न करने की क्षमता रखता है। माना जाता है कि सीएससी को कैंसर रिलेप्स और मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार माना जाता है क्योंकि उनकी क्षमताओं के कारण आत्म-नवीकरण और नए ट्यूमर को सीडिंग किया जाता है, साथ ही पारंपरिक कीमो और रेडियोथेरेपी4के लिए उनका प्रतिरोध भी है । इसलिए, सीएससी को लक्षित करना और सीएससी को समाप्त करना उपचार में सुधार और कैंसर रोगियों की मृत्यु दर को कम करने के लिए एक रोमांचक क्षमता प्रदान करता है ।
सीएससी को कई प्रकार के ठोस ट्यूमर से अलग किया गया है5. 2009 में, मानव गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों से अलग गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल (जीसीएस) को मूल रूप से ताकाइची एट अल6द्वारा वर्णित किया गया था। चेन और उनके सहयोगियों ने सबसे पहले मानव गैस्ट्रिक एडेनोकार्सिनोमा (जीएसी) ट्यूमर ऊतकों7से जीसीएस की पहचान और शुद्ध किया । ये निष्कर्ष न केवल जीसीएस जीव विज्ञान का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं बल्कि महान नैदानिक महत्व भी प्रदान करते हैं ।
सीएससी की एक विशेष विशेषता गोला8बनाने की उनकी क्षमता है . एकल कोशिकाओं को कम घनत्व पर गैर-साक्षर परिस्थितियों में चढ़ाया जाता है, और केवल आत्म-नवीकरण के साथ कोशिकाएं एक ठोस, गोलाकार क्लस्टर में विकसित हो सकती हैं जिन्हें एक गोलाकार कहा जाता है। इस प्रकार, क्षेत्र गठन परख सोने के मानक परख के रूप में माना जाता है और व्यापक रूप से स्टेम सेल आत्म विट्रो में नवीकरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया ।
आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक विशिष्ट जीन9के नॉकडाउन द्वारा जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है। हालांकि, दीर्घकालिक स्थिर जीन नॉकडाउन प्रौद्योगिकियों की कुछ सीमाएं होती हैं, जैसे कि कोशिका अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन के कार्य की खोज की चुनौती। सशर्त आरएनएआई सिस्टम एक उत्प्रेरण एजेंट के प्रशासन द्वारा एक लौकिक और/या विशेष नियंत्रित तरीके से वांछित जीन के डाउनरेगुलेशन के लिए उपयोगी हो सकता है । टेट्रासाइक्लिन (टीईटी) -अक्षूणीय प्रणालियां सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सशर्त आरएनएआई प्रणालियों में से एक हैं10। टीईटी-प्रेरक प्रणालियां एक बहिर्जात प्रेरक (अधिमानतः डॉक्सीसाइक्लिन, डॉक्स) के अलावा श्रणाणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करके लक्षित जीन को प्रेरित कर सकती हैं। टीईटी-इनकक्षीय प्रणालियों को दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: टीईटी-ऑन या टीईटी-ऑफ सिस्टम। श्रावक की अभिव्यक्ति को प्रेरक की उपस्थिति में चालू (टीईटी-ऑन) या बंद (टीईटी-ऑफ) किया जा सकता है। एक प्रेरक के बिना टीईटी-ऑन प्रणाली में, संविलियन व्यक्त टीईटी दमन (टेटआर) टीईटी-उत्तरदायी तत्व (टीईए) अनुक्रम से बांधता है जिसमें छर्रा अभिव्यक्ति के लिए टीईटी-उत्तरदायी पोल III-निर्भर प्रमोटर होता है, इस प्रकार श्रणा की अभिव्यक्ति का दमन होता है । जबकि डॉक्स के अलावा, TetR टीईटी-उत्तरदायी पीओएल III-निर्भर प्रमोटर से दूर तनहा है । यह श्र्ना की अभिव्यक्ति को सुविधाजनक बनाता है और जीन नॉकडाउन की ओर जाता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न जीसीएस में क्लस्टरिन के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक कार्यात्मक टेट्रासाइक्लिन-अक्षुण्ण श्रावक प्रणाली और एक अनुकूलित क्षेत्र गठन परख को नियोजित करता है । क्लस्टरिन को पिछले अध्ययन11में जीसीएस के स्टेमनेस और अस्तित्व को बनाए रखने के लिए एक उपन्यास कुंजी अणु के रूप में पहचाना गया है । हम जीसीएस स्वयं नवीकरण में क्लस्टरइन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं। यह कार्यप्रणाली अन्य प्रकार के कैंसर स्टेम सेल पर भी लागू होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीसी दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौत का तीसरा प्रमुख कारण है । जीसीएस गैस्ट्रिक कैंसर रिलेप्स, मेटास्टेसिस और ड्रग रेजिस्टेंस में महत्वपूर्ण हैं। गैस्ट्रिक कैंसर रोगियों से जीसीएस का उपयोग करने स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को गुआंगदोंग प्रांत के नेचर साइंस फाउंडेशन (2018A030310586) द्वारा समर्थित किया गया था, 2020A1515010989), गुआंगदोंग प्रांत के मेडिकल साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन (A2019405), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (८१७७२९५७), विज्ञान और चीन में गुआंगदोंग प्रांत के प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2017B030301016), और शेनझेन के उद्योग और सूचना प्रौद्योगिकी फाउंडेशन (२०१८०३०९१००१३५८६०) ।
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
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