استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية
Summary
هنا، نقدم طريقة معدلة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة، فضلا عن بروتوكول يُشبه استخدام الأجنة المذابة بالتجميد والكهربية من أجل الجيل الفعال من الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
أصبح استخدام الفئران المعدلة وراثياً أمراً حاسماً لفهم وظيفة الجينات وفك رموز الآليات الأساسية للأمراض البشرية. يسمح نظام CRISPR/Cas9 للباحثين بتعديل الجينوم بكفاءة وإخلاص وبساطة لم يسبق لها مثيل. تسخير هذه التكنولوجيا ، والباحثين يبحثون عن بروتوكول سريع وفعال وسهل لتوليد الفئران المعدلة وراثيا. هنا نقدم طريقة محسنة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة التي تؤدي إلى معدل نمو أعلى للأجنة المذابة بالتجميد. من خلال الجمع بين ذلك مع ظروف الكهربة الأمثل ، يسمح هذا البروتوكول بتوليد فئران بالضربة القاضية وتدق بكفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة في غضون وقت قصير. وعلاوة على ذلك، نعرض شرحا خطوة بخطوة لبروتوكولنا الأمثل، الذي يغطي إعداد كاشف CRISPR، وفي الإخصاب في المختبر، والحفاظ على التبريد وذوبان الأجنة من خلية واحدة، والكهرباء من الكواشف CRISPR، وتوليد الماوس، والنماذج الجينية للمؤسسين. باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون الباحثون قادرين على إعداد فئران جنرال موتورز بسهولة وسرعة وكفاءة لا مثيل لها.
Introduction
المجمعة بانتظام متباعدة قصيرة palindromic يكرر (CRISPR) / CRISPR المرتبطة بروتين 9 (Cas9) النظام هو اختراق العلمية التي توفر التعديل المستهدف لم يسبق له مثيل في الجينوم1. يتكون نظام CRISPR/Cas9 من بروتين Cas9 ودليل RNA (gRNA) مع اثنين من المكونات الجزيئية: الحمض النووي الريبي CRISPR المحدد (crRNA) وCRISPR RNA عبر التنشيط (tracrRNA)2 . وgRNA يوجه بروتين Cas9 إلى مكان محدد في الجينوم، 20 النيوكليوتيدات المكملة لcrRNA، والمتاخمة للعزر البروتوساتير المجاورة (PAM). يرتبط بروتين Cas9 بالتسلسل المستهدف ويحفز فواصل حبلا مزدوجة (DSBs) التي يتم إصلاحها إما عن طريق الانضمام إلى النهاية غير المتجانسة المعرضة للخطأ (NHEJ) أو إصلاح توجيه homology عالي الدقة (HDR)3،4،5. ويؤدي دليل النهيج إلى عمليات إدراج أو/وحذف (indels)، وبالتالي إلى فقدان الجينات للوظيفة عندما يتم استهداف تسلسل الترميز. HDR يؤدي إلى تحرير الجينوم دقيقة في وجود قالب إصلاح يحتوي على تسلسل homology3،4،5. وقد تم تسخير NHEJ وHDR لتوليد الفئران بالضربة القاضية وتدق في، على التوالي.
في حين أن نظام CRISPR/Cas9 قد سرّع بشكل ملحوظ من توليد فئران جنرال موتورز ذات الفعالية والإخلاص المتميزين، فإن العلماء الذين يطبقون هذه الأساليب غالبًا ما يواجهون تحديات تقنية. أولاً، تتطلب البروتوكولات التقليدية الحقن المجهري لإدخال أدوات تحرير CRISPR في النواة الأولية للبويضات المخصبة6،7. هذه التقنية تستغرق وقتا طويلا وعادة ما تتطلب تدريبا مكثفا. وهكذا، عدة مجموعات استبدال الحقن المجهري مع الكهربة8،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، في بروتوكولات الكهربة المبكرة تم استخدام الأجنة الطازجة للتكهرب. وهذا تسبب في مشكلة أخرى ، لأن إعداد الأجنة الطازجة قبل كل تجربة أمر صعب14.
في الآونة الأخيرة قمنا نحن وآخرون بالجمع بين استخدام الأجنة المذابة بالتجميد والكهرباء لتحرير الجينوم ، مما يسهل توليد الفئران المعدلة وراثيا15،16. ويمكّن هذا البروتوكول الباحثين الذين لا يملكون مهارات متقدمة في التلاعب بالأجنة من توليد نماذج الحيوانات بسرعة من الأمراض البشرية بكفاءة عالية. البروتوكول يقلل أيضا بشكل كبير من التحديات العملية في توليد الفئران المعدلة وراثيا، مثل عدم التجانس الجيني في المؤسسين16. للتغلب على الفسيفساء ، نقوم بإجراء الكهربورة لكواشف CRISPR في غضون ساعة واحدة بعد إذابة الجنين لضمان حدوث التحرير قبل النسخ المتماثل الأول للجينوم. تحسين آخر يشمل استخدام بروتين Cas9 بدلا من Cas9 مرنا للحد من الفسيفساء غير المرغوب فيها17. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير طريقة مثالية للحفاظ على التبريد الجنين يخلية واحدة أن يزيد من معدل النمو إلى المرحلة الثانية من الخلية16: استخدام مصل الأبقار الجنينية (FBS) يحسن بشكل كبير بقاء البويضات المذابة بالتجميد بعد الإخصاب، وربما من خلال نفس الآلية التي تجعل البويضات غير المخصبة المذابة بالتجميد أكثر مرونة18.
نقدم هنا بروتوكولًا شاملًا لتوليد فئران المعدلة وراثياً باستخدام أجنة مذابة بالتجميد، بما في ذلك الطريقة المعدلة للحفظ بالتبريد لأجنة C57BL/6J ذات الخلية الواحدة. ويشمل 1) تصميم gRNA، إعداد كاشف CRISPR والتجميع؛ 2) التلقيح الاصطناعي، والحفاظ على التبريد، وذوبان الأجنة من خلية واحدة؛ 3) الكهربية من الكواشف CRISPR في الأجنة المذابة بالتجميد؛ 4) نقل الجنين إلى أوفيقناة الفئران الأنثوية الحامل للحوامل؛ 5) Genotyping وتحليل تسلسل الحيوانات مؤسس F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول الموصوف بتوليد فئران جنرال موتورز ذات كفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة(الجدول 1). فهو يمكّن الباحثين الذين لا يتمتعون بمهارات متقدمة في التلاعب بالأجنة من إنشاء فئران متحولة بسهولة لأنها تستفيد من أحدث التطورات وأكثرها فائدة في كل من الهندسة الإنجابية وتقنيات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر هيتومي ساوادا وإليزابيث غارسيا على رعاية الحيوانات. تم دعم هذا العمل من قبل KAKENHI (15K20134 ، 17K11222 ، 16H06276 و 16K01946) ومنحة هوكينجين للأبحاث (إلى H.N) ، وجائزة الباحث الشاب بجامعة جيتشي الطبية (إلى H.U. ). دعمت مؤسسة أوتسوكا توشيمي للمنح الدراسية ماجستير في التعليم.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
