आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उच्च दक्षता उत्पादन के लिए फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग
Summary
यहां, हम एक कोशिका भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ-साथ एक प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधित विधि पेश करते हैं जो आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की कुशल पीढ़ी के लिए फ्रीज-गल भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन का उपयोग जोड़ता है।
Abstract
आनुवंशिक रूप से संशोधित (जीएम) चूहों का उपयोग जीन कार्य को समझने और मानव रोगों के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । CRISPR/Cas9 प्रणाली शोधकर्ताओं को अभूतपूर्व दक्षता, निष्ठा, और सादगी के साथ जीनोम को संशोधित करने की अनुमति देता है । इस तकनीक का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता जीएम चूहों को पैदा करने के लिए एक त्वरित, कुशल और आसान प्रोटोकॉल की मांग कर रहे हैं। यहां हम एक कोशिका भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक बेहतर विधि पेश करते हैं जो फ्रीज-गल भ्रूण की उच्च विकास दर की ओर जाता है। अनुकूलित इलेक्ट्रोपोशन स्थितियों के साथ इसे जोड़कर, यह प्रोटोकॉल कम समय के भीतर उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों के साथ नॉकआउट और दस्तक चूहों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हम अपने अनुकूलित प्रोटोकॉल का एक कदम-दर-कदम स्पष्टीकरण दिखाते हैं, जिसमें CRISPR रिएजेंट तैयारी, इन विट्रो निषेचन, क्रायोप्रिजर्वेशन और एक-सेल भ्रूण, CRISPR रिएजेंट्स का इलेक्ट्रोपोरेशन, माउस जनरेशन और संस्थापकों के जीनोटिपिंग को शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, शोधकर्ताओं को अद्वितीय आसानी, गति और दक्षता के साथ जीएम चूहों को तैयार करने में सक्षम होना चाहिए।
Introduction
संकुल नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) प्रणाली एक वैज्ञानिक सफलता है जो जीनोम1में अभूतपूर्व लक्षित संशोधन प्रदान करती है । CRISPR/Cas9 प्रणाली Cas9 प्रोटीन और गाइड आरएनए (gRNA) दो आणविक घटकों के साथ शामिल है: एक लक्ष्य विशिष्ट CRISPR आरएनए (crRNA) और एक ट्रांस सक्रिय CRISPR आरएनए (tracrRNA)2 । एक एसआरएनए कै9 प्रोटीन को जीनोम में विशिष्ट लोकस, क्रेना के पूरक 20 न्यूक्लियोटाइड्स और प्रोटोस्तेजक आसन्न आकृति (पाम) के निकट निर्देश देता है। Cas9 प्रोटीन लक्ष्य अनुक्रम को बांधता है और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) को प्रेरित करता है जो या तो त्रुटि-प्रवण नॉनहोमोकोगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) या उच्च निष्ठा होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)3,4,4,5द्वारा मरम्मत की जाती है। NHEJ सम्मिलन या/और हटाने (indels) की ओर जाता है, और इसलिए समारोह के जीन हानि के लिए जब एक कोडिंग अनुक्रम लक्षित है । एचडीआर में होमोलॉजी सीक्वेंस3,4,,5युक्त मरम्मत टेम्पलेट की उपस्थिति में सटीक जीनोम संपादन होता है । NHEJ और HDR क्रमशः नॉकआउट और नॉक-इन चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
जबकि CRISPR/Cas9 प्रणाली स्पष्ट रूप से उत्कृष्ट प्रभावकारिता और निष्ठा के साथ जीएम चूहों की पीढ़ी में तेजी आई है, वैज्ञानिकों जो इन तरीकों को लागू अक्सर तकनीकी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । सबसे पहले, पारंपरिक प्रोटोकॉल को निषेचित अंडों6,,7के प्रणोदक में CRISPR संपादन उपकरण शुरू करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन की आवश्यकता होती है। यह तकनीक समय लेने वाली है और आमतौर पर व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, कई समूहों ने माइक्रोइंजेक्शन को इलेक्ट्रोपोरेशन8,9,,10,,11,12,13से बदल दिया । हालांकि, शुरुआती इलेक्ट्रोपोशन प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोपोराशन के लिए ताजा भ्रूण का उपयोग किया जाता था। यह एक और समस्या का कारण बना है, क्योंकि प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा भ्रूण तैयार करना मुश्किल14है ।
हाल ही में हमने और अन्य लोगों ने जीनोम संपादन के लिए फ्रीज-गल भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन के उपयोग को संयुक्त किया है, जो जीएम चूहों15,,16की पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल उच्च दक्षता के साथ मानव रोगों के पशु मॉडल को तेजी से उत्पन्न करने के लिए उन्नत भ्रूण हेरफेर कौशल के बिना शोधकर्ताओं को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल भी काफी जीएम चूहों, जैसे संस्थापकों16में आनुवंशिक विषमता के रूप में पैदा करने में व्यावहारिक चुनौतियों को कम कर देता है । मोज़ेकवाद पर काबू पाने के लिए, हम भ्रूण विगलन के बाद 1 घंटे के भीतर CRISPR अभिकर्म का कार्य करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जीनोम की पहली प्रतिकृति से पहले संपादन होता है। एक अन्य सुधार में अवांछनीय मोज़ेकिज्म17को कम करने के लिए Cas9 mRNA के बजाय Cas9 प्रोटीन का उपयोग शामिल है । इसके अलावा, हमने एक-कोशिका भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक इष्टतम विधि विकसित की है जो विकास दर को दो-सेल चरण16तक बढ़ाती है: भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का उपयोग नाटकीय रूप से निषेचन के बाद फ्रीज-गल ओसाइट्स के अस्तित्व में सुधार करता है, शायद उसी तंत्र द्वारा जो फ्रीज-गल गए निषेचित oocytes को अधिक लचीलाबनाताहै।
यहां हम जीएम चूहों की पीढ़ी के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल पेश फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग कर, एक सेल C57BL/6J भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए संशोधित विधि सहित । इसमें 1) जीआरएनए डिजाइन, CRISPR रिएजेंट तैयारी और असेंबली शामिल है; 2) आईवीएफ, क्रायोप्रिजर्वेशन, और एक सेल भ्रूण की विगलन; 3) फ्रीज-गल भ्रूण में CRISPR अभिकर्मकों के इलेक्ट्रोपोरेशन; 4) भ्रूण छद्म गर्भवती मादा चूहों के अंडाशय में स्थानांतरण; और 5) F0 संस्थापक जानवरों के Genotyping और अनुक्रम विश्लेषण।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों(तालिका 1)के साथ जीएम चूहों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह उन्नत भ्रूण हेरफेर कौशल के बिना शोधकर्ताओं को आसानी से उत्परिवर्ती चूहों बनाने के लिए …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पशु देखभाल के लिए हितोमी सावदा और एलिजाबेथ गार्सिया का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 और 16K01946) और Hokugin अनुसंधान अनुदान (एच.एन.) और जिची मेडिकल विश्वविद्यालय युवा अन्वेषक पुरस्कार (एचयू के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था । ओत्सुका तोशिमी स्कॉलरशिप फाउंडेशन ने एमडी का समर्थन किया ।
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
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