Bruk av frysetinte embryoer for høyeffektivitetsproduksjon av genmodifiserte mus
Summary
Her presenterer vi en modifisert metode for kryopreservation av encellede embryoer, samt en protokoll som parer bruken av frysetinte embryoer og elektroporasjon for effektiv generering av genmodifiserte mus.
Abstract
Bruken av genmodifiserte (GM) mus har blitt avgjørende for å forstå genfunksjon og dechiffrere de underliggende mekanismene for menneskelige sykdommer. CRISPR/Cas9-systemet gjør det mulig for forskere å modifisere genomet med enestående effektivitet, troskap og enkelhet. Ved å utnytte denne teknologien søker forskere en rask, effektiv og enkel protokoll for generering av GM-mus. Her introduserer vi en forbedret metode for kryopreservation av encellede embryoer som fører til en høyere utviklingshastighet av frysetinte embryoer. Ved å kombinere den med optimaliserte elektroporasjonsforhold, gir denne protokollen generering av knockout og knock-in mus med høy effektivitet og lave mosaikkhastigheter på kort tid. Videre viser vi en trinnvis forklaring av vår optimaliserte protokoll, som dekker CRISPR reagensforberedelse, in vitro befruktning, kryopreservation og tining av encellede embryoer, elektroporasjon av CRISPR-reagenser, musegenerering og genotyping av grunnleggerne. Ved hjelp av denne protokollen bør forskerne kunne forberede GM-mus med uovertruffen letthet, hastighet og effektivitet.
Introduction
Det grupperte regelmessig ekle korte palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) systemet er et vitenskapelig gjennombrudd som gir enestående målrettet endring i genomet1. CRISPR/Cas9-systemet består av Cas9-protein og guide RNA (gRNA) med to molekylære komponenter: en målspesifikk CRISPR RNA (crRNA) og en transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA)2 . En gRNA leder Cas9-proteinet til det spesifikke locus i genomet, 20 nukleotider komplementære til crRNA, og ved siden av protospacer tilstøtende motiv (PAM). Cas9-proteinet binder seg til målsekvensen og induserer dobbelttrådpauser (DSBs) som repareres av enten feilutsatt nonhomolog endesammenføyning (NHEJ) eller high fidelity homology-rettet reparasjon (HDR)3,,4,5. NHEJ fører til innsettinger eller/og slettinger (indels), og dermed til gentap av funksjon når en kodesekvens er målrettet. HDR fører til presis genomredigering i nærvær av en reparasjonsmal som inneholder homologisekvenser3,,4,,5. NHEJ og HDR har blitt utnyttet til å generere knockout og knock-in mus, henholdsvis.
Mens CRISPR/Cas9-systemet har akselerert genereringen av GM-mus med enestående effekt og troskap, møter forskere som bruker disse metodene ofte tekniske utfordringer. For det første krever konvensjonelle protokoller mikroinjeksjon for innføring av CRISPR-redigeringsverktøyene i pronucleus av befruktede egg6,,7. Denne teknikken er tidkrevende og krever vanligvis omfattende opplæring. Dermed erstattet flere grupper mikroinjeksjon med elektroporasjon8,9,10,11,12,13. I de tidlige elektroporasjonsprotokollene ble imidlertid friske embryoer brukt til elektroporasjon. Dette forårsaket et annet problem, fordi å forberede friske embryoer før hvert eksperiment er vanskelig14.
Nylig har vi og andre kombinert bruken av frysetinte embryoer og elektroporasjon for genomredigering, noe som letter genereringen av GM-mus15,16. Denne protokollen gjør det mulig for forskere uten avanserte embryomanipulasjonferdigheter å raskt generere dyremodeller av menneskelige sykdommer med høy effektivitet. Protokollen reduserer også praktiske utfordringer i å generere GM-mus, for eksempel genetisk heterogenitet hos grunnleggerne16. For å overvinne mosaikkisme utfører vi elektroporasjonen av CRISPR-reagenser innen 1 h etter embryotining for å sikre at redigering skjer før den første replikeringen av genomet. En annen forbedring inkluderer bruk av Cas9 protein i stedet for Cas9 mRNA for å redusere uønsket mosaikkisme17. Videre utviklet vi en optimal metode for encellede embryokryopreservation som øker utviklingshastigheten til to-celle stadium16: bruk av føtale storfe serum (FBS) dramatisk forbedrer overlevelsen av fryse-tint oocytes etter befruktning, kanskje av samme mekanisme som gjør fryse-tint ubefruktet oocytes mer motstandsdyktig18.
Her presenterer vi en omfattende protokoll for generering av GM-mus ved hjelp av frysetinte embryoer, inkludert den modifiserte metoden for kryopreservation av encellede C57BL/6J embryoer. Det inkluderer 1) gRNA design, CRISPR reagensforberedelse og montering; 2) IVF, kryopreservation, og tining av encellede embryoer; 3) Elektroporasjon av CRISPR reagenser i frysetinte embryoer; 4) Embryo overføring til oviduct av pseudopregnant kvinnelige mus; og 5) Genotyping og sekvens analyse av F0 grunnlegger dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokollen gjør det mulig for generering av GM-mus med høy effektivitet og lave mosaikkhastigheter (Tabell 1). Det gjør det mulig for forskere uten avanserte embryomanipulasjonsferdigheter å lage muterte mus lett fordi det utnytter de nyeste og mest nyttige fremskrittene innen både reproduktiv ingeniør- og genomredigeringsteknologier: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) og elektroporasjon til frysetinte embryoer. Disse fremskrittene tilrettelagt og fremskyndet generering av GM-musene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Hitomi Sawada og Elizabeth Garcia for dyrepleie. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 og 16K01946) og Hokugin Research Grant (til H.N.), og Jichi Medical University Young Investigator Award (til H.U.). Otsuka Toshimi Scholarship Foundation støttet MD.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
