Summary
Vi beskriver isolering, spridning och plätering av tandmassa (DP) primära celler med trigeminal (TG) nervceller odlade ovanpå överliggande transwell filter. Cellulära svar av DP-celler kan analyseras med immunofluorescens eller RNA/proteinanalys. Immunofluorescens av neuronala markörer med konfokal mikroskopi tillåter analys av neurite utväxt svar.
Abstract
Tand innervation tillåter tänder att känna av tryck, temperatur och inflammation, som alla är avgörande för användning och underhåll av tandorganet. Utan sensorisk innervation, dagliga muntliga aktiviteter skulle orsaka irreparabel skada. Trots dess betydelse har rollerna för inre vation i tandutveckling och underhåll till stor del förbisetts. Flera studier har visat att DP-celler utsöndrar extracellulära matrisproteiner och paracrine signaler för att locka och vägleda TG axoner till och i hela tanden. Men få studier har gett detaljerad insikt i tvärsnittet mellan DP mesenchyme och neuronal afferents. För att ta itu med denna klyfta i kunskap, forskare har börjat utnyttja samkulturer och en mängd olika tekniker för att undersöka dessa interaktioner. Här visar vi flera steg som är inblandade i co-odling primära DP celler med TG nervceller spridda på en överliggande transwell filter med stor diameter porer för att möjliggöra axonal tillväxt genom porerna. Primära DP-celler med genav intresse flankerad av loxP platser användes för att underlätta genborttagning med hjälp av en Adenovirus-Cre-GFP rekombinas system. Använda TG nervceller från Thy1-YFP musen tillåtet för exakt afferent imaging, med uttryck långt över bakgrundsnivåer genom konfokal mikroskopi. DP-svaren kan undersökas via protein- eller RNA-insamling och analys, eller alternativt genom immunfluorescerande färgning av DP-celler som pärperats på avtagbara glastäcke. Media kan analyseras med hjälp av tekniker som proteomiska analyser, även om detta kommer att kräva albumin utarmning på grund av förekomsten av fetala nötkreatur serum i media. Detta protokoll ger en enkel metod som kan manipuleras för att studera morfologiska, genetiska och cytoskeletala svar av TG nervceller och DP-celler som svar på den kontrollerade miljön i en samkultur analys.
Introduction
Tand innervation tillåter tänder att känna av tryck, temperatur och inflammation, som alla är avgörande för användning och underhåll av tandorganet. Underlåtenhet att känna tandsmärta i samband med karies och trauma leder till sjukdomsprogression. Således är korrekt innervation ett krav för normal tandtillväxt, funktion och vård.
Medan de flesta organ är fullt fungerande och innervated vid tidpunkten för födseln, tandutveckling sträcker sig in i vuxenlivet, med tand innervation och mineralisering förekommer i samförstånd under postnatal stadier1,2. Intressant nog utsöndrar tandmassa (DP) mesenchyme inledningsvis stöter bort vinklingsignaler under embryogenesis för att förhindra axoninträde i det utvecklande tandorganet, som senare skiftar till utsöndringen av attractantfaktorer som tanden närmar sig utbrott3,4. Under postnatal stadier, afferent axons från trigeminal (TG) nerv tränger in i och hela tanden runt tiden dentin nedfall börjar (ses över i Pagella, P. et al.5). Flera in vivo studier har visat att neuronal-mesenchymal interaktioner vägleda tand innervation hos möss (ses över i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om de molekylära mekanismerna finns tillgängliga.
Cell co-kulturer ger kontrollerade miljöer där utredarna kan manipulera interaktioner mellan neuronala och mesenchymal populationer. Samkulturexperiment gör det möjligt att gräva djupare in i signalvägarna som styr tandinnervation och utveckling. Flera av de konventionella metoder som används för att studera celler i samkulturen innebär dock tekniska utmaningar. Till exempel, kristall violett färgning av neurite utväxt kan icke-specifikt fläck Schwann celler som ingår i TG bunt spridningar, och det kan finnas toppar i färgintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidiska kammare erbjuder ett attraktivt alternativ, men är betydligt dyrare än transwell filter8,9 och bara tillåta undersökning av neuronala svar på DP sekret. För att ta itu med dessa frågor har vi utvecklat ett protokoll som möjliggör: a) exakt färgning och bildbehandling av TG neurite utväxt som svar på DP sekret, b) genetisk modifiering av DP-celler och / eller TG nervceller för att undersöka specifika signalering vägar, och c) undersökning av DP cell svar på faktorer som utsöndras av TG nervceller. Detta protokoll ger möjlighet att exakt undersöka flera funktioner i tand innervation i den kontrollerade miljön i en in vitro samkultur analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med möss godkändes av UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Plattberedning
Obs: Omslagsskydd kan användas för att bild DP-celler i slutet av analysen. Se till att plåtlocket är på under all inkubation och sköljsteg utanför den sterila vävnadsodlingshuven för att förhindra kontaminering under provbearbetning.
-
Coverslip beredning
- Autoklav cirkulära omslagsskydd.
- Filtrera ultrarent vatten under huven.
- Överför täcksnedlaget till en 24-brunnsplatta och täck var och en med 400 μL 0,1 mg/ml poly-D-lysin.
- Låt täckreglaget blötlägga, nedsänkt i 5 min, på en rocker på 12 rpm eller orbital shaker på 40-50 rpm. Se till att locket är på för att förhindra kontaminering.
- Skölj täckreglaget med filtrerat ultrarent vatten i ca 5 min på en rocker vid 12 rpm eller shaker vid 50 rpm. Upprepa.
- Låt täcksbackarna torka i minst 2 h under huven med plattans lock av för att underlätta avdunstning. Dessa täckskydd bör användas inom 48 timmar.
- Seed DP-celler ovanpå täcksskydd och process i slutet av analysen för immunfluorescens (avsnitt 3.3).
-
Beläggningsfilter
- Späd laminin till 10 μg/ml. Filtrera utspädd laminin under huven.
- Pipette 450-500 μL 10 μg/ml laminin i varje brunn av en 24-brunnsplatta.
- Placera transwellfilter, 3 μm porositet, i en brunn så att den kontaktar lamininlösningen och lämna det i en 37 °C-inkubator för antingen 2 h eller över natten. Filterpores bör tillåta en del av lösningen att sprida och päls både toppen och botten av filtret. Dessa filter bör användas inom 48 timmar eller kylas vid 4 °C i upp till 1 vecka.
2. Cellplätering med valfri genetisk manipulation
- Möss: Genetisk förändring av DP-celler kan utföras (men krävs inte) för att studera mesenchymal-neuronal interaktioner. Se avsnitten 2.3 och 2.4 för föreslagna genetiska variationer.
- DP dissekering, spridning och plätering(figur 1)
OBS: För DP dissekering, använd ultra-fina, rak kantpinningar. De ultrafina kanterna gör det möjligt för användaren att kila kraftkanten mellan den mineraliserade strukturen och DP-vävnaden.- Skörda P5-P8 möss. I detta skede bör tänderna mineralisera, och roten är öppen.
- Bedövningsmedlor via hypotermi genom att placera dem i en maträtt i 4 ° C kylskåp tills de inte längre flytta eller svara på beröring. Avliva nyfödda genom halshuggning och i enlighet med IACUC:s förfaranden vid den utsedda anläggningen.
- Förbered en 3-5 ml aliquot på 0,25% trypsin-EDTA i en 50 ml konisk rör för att samla DP från varje mus. Detta kommer att underlätta matsmältningen av tandmassa från postnatala möss. Använd mer än 3 ml om smältavävnad från mer än 10 postnatala möss.
- Placera huvudet på en engångsunderplatta så att munnen är mot taket och basen av halsen är platt på arbetsytan. Använd ett rakblad i en sågrörelse för att separera underkäken från maxilla.
- Ta bort tungan eventuellt antingen med sax eller med pincett för att underlätta åtkomsten till kindtänderna.
- Placera det öppnade huvudet i en disk ovanpå en steril gasvävsdynoch placera exemplaret under ett dissekerande mikroskop(figur 1D).
- Ta bort alveolar benvävnad en omgivande första kindtänderna. Submandibular tänder är inte helt utbröt på denna punkt. Sätt pincett i alveolar öppning och retas vävnaden bort från tanden mot buccal (kinden) eller lingual (tungan) sidan av munnen. Maxillary tänder kommer att kräva fullt avlägsnande av kluven runt tanden för exponering och borttagning.
- Överför försiktigt submandibular och maxillary första kindtänderna (M1s) till en separat cell kultur rätt med 1x fosfat-buffrad realine (PBS).
- Upprepa 2.2.4-2.2.8 tills alla M1s samlas in. Förvara skålen som innehåller M1:orna på isunder skörden.
- Ta bort EOE:n (EOE) som omger utsidan av varje M1. Detta kan alternativt göras efter steg 2.2.11.
- Med en uppsättning pincett, rotera M1 så att cusps är nere och den öppna roten exponeras. Det kommer att finnas en oval öppning på botten av tanden, och ogenomskinlig DP vävnad inkapslade av ett tunt lager av dentin och emalj.
- Med hjälp av spetsen på pincetten, lossa försiktigt DP genom att köra en arm av pincetten runt den inre omkretsen av den mineraliserade vävnaden. Ta bort DP-vävnad ur den mineraliserade strukturen och överför den till en tredje maträtt som innehåller 1x PBS. Ta bort EOE om det inte redan var separerat (bild 1E).
- Överför all DP-vävnad till 0,25% trypsin-EDTA i ett 50 ml koniskt rör. Vortex blandningen och placera i en 37 ° C varmt vatten bad i 10 min. Detta kan göras med samma pincett eller med långa, injektionskraft. Vävnaden kommer att bli svår att skingra och kommer att kräva virvlande var 3-4 min. Överskrid INTE 10 min trypsinization eftersom trypsin kan skada cellmembranen.
- Under en steril huva, tillsätt uppvärmda co-culture media(tabell 1) till ett slutligt förhållande av minst 1:1 media till trypsin att inaktivera enzymet. Större förhållanden är acceptabla om mer vävnadsspridning önskas.
- Pipette media upp och ner flera gånger med en 10 ml pipett för att ytterligare skingra DP i media. Var noga med att undvika stora bubblor. Fullständig spridning är nästan omöjligt på grund av vävnadens klibbiga natur. Det är dock inte heller nödvändigt eftersom celler kommer att migrera utåt från vävnaden när de är pläterade.
- Överför 1 ml av den spridda DP till varje brunn av en 24-brunn vävnad kultur tallrik(Figur 1F).
- Placera plattan i en inkubator vid 37 °C och låt cellerna fästa och migrera ut från den ospridda vävnaden i 48 timmar innan du byter media. Primära celler måste pläteras vid relativt höga koncentrationer för att nå 85-90% sammanflödet inom 1 vecka. Om detta inte uppnås efter 1 vecka, kassera plattan.
- Genetisk manipulation av DP-celler som tillval
- För att ändra cellsignaleringsvägar, skörda DP-celler från genetiska knockoutmöss eller från möss där en gen av intresse flankeras av loxP-platser. I det senare fallet kan genen tas bort med Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) recombinase för att ta bort den flankerade genen, enligt beskrivningen nedan. Använd Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) som ett kontrollvirus för att säkerställa att virusinfektionen inte orsakar ett cellulärt svar.
OBS: Ad-eGFP styrs av CMV promotor förstärkare, som är mycket stark. Ad-Cre-GFP regleras av en IRES, en intern regleringsregion mellan Cre och GFP, som inte är särskilt stark. Detta resulterar i ljusare fluorescens i Ad-eGFP-celler än Ad-Cre-GFP-celler. Bekräfta motsvarande infektionsnivåer baserat på det totala antalet celler fluorescerande, inte på nivåerna av cellulär fluorescens. - Förbered 500 μl medier som innehåller virus och 10 μg/ml polybrene per brunn. Polybrene hjälper till med virusinfektion i celler nära sammanflödet10. Detta protokoll är baserat på en mångfald av infektion (MOI) på 100 för Ad-eGFP och 200 Ad-Cre-GFP för effektiv geninfektion med liten eller ingen effekt på cellens livskraft. Det uppskattade cellnumret är 4 x 104 celler/brunn på en 24-brunnsplatta:
- Blanda media med kort virvlande eller pipetting och tillsätt 500 μL till varje brunn.
- Efter 24 h, tillsätt ytterligare 500 μl samkulturmedia som inte innehåller ytterligare polybrene eller virus.
- Efter totalt 48 h, aspirate virus-innehållande media och ersätta med färska samkultur media. Vid denna punkt, TG nervceller kan läggas ovanpå transwell filter.
- För att ändra cellsignaleringsvägar, skörda DP-celler från genetiska knockoutmöss eller från möss där en gen av intresse flankeras av loxP-platser. I det senare fallet kan genen tas bort med Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) recombinase för att ta bort den flankerade genen, enligt beskrivningen nedan. Använd Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) som ett kontrollvirus för att säkerställa att virusinfektionen inte orsakar ett cellulärt svar.
- Trigeminal neuron dissekering, spridning och plätering
OBS: I detta protokoll optimerades avbildningen av neuriteutväxt i samkultur med DP-celler med hjälp av ungdomar (6 veckor gamla) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J möss. Centrala och perifera nervsystemet hos Thy1-YFP möss har en gul fluorescerande protein (YFP) tagg vars uttryck börjar runt P6-P10 i nervceller och ökar exponentiellt i hela nervsystemet under postnatal och vuxenliv11,12. YFP och GFP har bevarat sekvenser som gör att dessa nerver kan färgas med anti-GFP antikroppar, vilket resulterar i en pan-neuronal fläck. I slutändan, dessa möss möjliggör bättre visualisering och kvantifiering av nervceller som används och odlas i cellkultur.- Avliva unga möss med koldioxid följt av massundersökning störning.
- Halshugga mössen och ta bort huden från skallen. Var noga med att inkludera motsvarande antal män och kvinnor.
- Sätt i spetsen på ett par mikrodissekerande saxar i skallens botten. Skär längs skallens sagittala sutur(figur 1A).
- Gör fyra små horisontella snitt: två längs koronassuturer i öronen, och två längs lambdoid suturer vid basen av skallen. Detta bör skapa två klaffar av ben.
- Använd pincetten för att skala tillbaka de två klaffarna av ben. Detta borde avslöja hjärnan.
- Ta bort hjärnan. Överför huvudet till en vävnadskulturrätt med 1x PBS och lägg under mikroskopet.
- Lokalisera TG ganglierna, som är väl synlig hos gnagare13, inrymt i dura frågan mellan hjärnan och benet i maxillary processen(Figur 1B).
- Skär de tre grenar som reser till ögonen, maxillae och underkäken och överföra ganglia till kalla 1x PBS med rak kant fina pincett. Förvara skålen som innehåller TG-ganglierna på is under skörden.
- När alla TG buntar skördas, överföra ganglia till en 50 ml koniska röret som innehåller 5 mg/ml steril-filtrerade kollagen typ II med hjälp av injektionskraftagg.
- Vortex kollagen med TG-bunten och placera röret i ett vattenbad på 37 °C i 25-30 minuter. Under denna tid, ta det koniska röret ur vattenbadet, virveln och återgå till badet var 5-10 min.
- Centrifugera kollagen-TG neuron lösning för 2 min på 643 x g.
- Under en vävnadskultur huva, försiktigt aspirera kollagen med en micropipette.
- Tillsätt 5 ml 1% sterilfiltrerade trypsin typ II och virvel. Placera det koniska röret i ett vattenbad på 37 °C i 5 min.
- Centrifugera trypsin-TG mix i 5 min på 643 x g. Ta bort den övre delen av trypsin med en micropipette, så att TG nervceller inte tas bort. Det kommer fortfarande att finnas vätska i röret.
- Lägg till tillräckligt med media för att inaktivera de återstående trypsin (vid ett 1:1 eller lägre förhållande av trypsin till media).
- Räkna antalet celler och späd lösningen till 200 000 celler/ml (250 μl cellinnehållande 50 000 celler).
- Placera belagda transwellfilter från avsnitt 1.2 till brunnar med DP.
- Späd ut cellinnehållande lösningen så att det finns 200 000 celler/ml. Pipette 250 μL på transwellfiltret och odla cellerna vid 37 °C över natten(figur 1F).
- Nästa dag, ersätta media med 1 ml co-kultur media med 1 μM uridin och 15 μM 5'-fluor-2'deoxyuridine att stoppa överspridning av mesenchymala celler som kan förhindra neurite utväxt. Valfritt: Lägg till tillväxtfaktorer eller hämmare i detta media om du försöker ytterligare manipulation.
- Kultur cellerna för ytterligare önskade tidspunkter. Detta protokoll var optimerat för 5 totala dagar av kultur med media ändras endast på dag 2 för att lägga till mitotiska hämmare. Längre tidsperioder kräver ytterligare medieändringar.
3. Provtagning och bearbetning av stickprov
- Trigeminal färgning
- Pipette 1 mL aliquots av sterila 1x PBS i en 24-brunn tallrik under en vävnad kultur huva för varje transwell filter som skall bearbetas.
- Ta bort vätskan ovanpå filtret tas bort med en 200-1 000 μL pipett, var noga med att lämna celllagren intakta. Bifogade celler bör förbli fästa och obundna celler kommer att lossna under denna milda rörledningar. Ett vakuumfilter kan skada celllagret och rekommenderas inte för aspiration.
- Överför filtret till 1x PBS-plattan, se till att ta bort det översta lagret av media som nämns i föregående steg.
- Placera plattan med alla genomskinliga filter och lock på en rocker vid 12 varv/min eller 40-50 rpm på en orbital shaker i 10 min.
- Aspirera PBS, inklusive det översta lagret som beskrivs ovan, tillsätt 500 μL 1xPBS och placera på rocker eller orbital shaker för ytterligare 5-10 min sköljning.
- Aspirera 1x PBS en gång till och ersätta med 4% paraformaldehyd (PFA). Använd minst 500 μL så att hela filterytan är nedsänkt. Placera plattan på en rocker på 12 rpm eller orbital shaker vid 40-50 rpm vid rumstemperatur för 1 h.
- Ta bort PFA och skölj plattorna två gånger i 5-10 min vardera på en rocker med 500 μL 1x PBS.
- Block med 10% nötkreatur serum albumin (BSA) + 5% get / åsna serum, beroende på den sekundära antikroppar värd djur, i 0,05% Tween-1xPBS (PBST). Använd 450-500 μl lösning så att filtret är nedsänkt i vätskan.
OBS: I detta skede kan dessa plattor lagras vid 4 °C i flera månader för att bearbeta vid ett senare tillfälle. Använd parafilm för att täta plattan för att säkerställa avdunstning inte sker och kontrollera regelbundet för avdunstning så att filterytorna förblir nedsänkta. - Ta bort blocket och tillsätt 450-500 μl primärantikropp i 1% BSA-PBST utan ytterligare sköljning. Inkubera vid 4 °C över natten, försiktigt gunga.
- Ta bort primär antikroppslösning och skölj med 500 μL 1xPBST på en rocker, 3 gånger, vid rumstemperatur
- Ta bort PBST, tillsätt sekundär antikropp och inkubera på en rocker över natten vid 4 ° C insvept i aluminiumfolie för att skydda fluorofforer från ljusnedbrytning. Skölj igen, 3 gånger, med 1x PBST på en rocker i rumstemperatur. Byt ut med 1 x PBS.
OBS: Vid denna punkt kan plattan förvaras i flera månader vid 4 °C om den är insvept i aluminiumfolie för att förhindra fluorofforde nedbrytning. Använd parafilm för att täta plattan för att säkerställa avdunstning inte sker och kontrollera regelbundet för avdunstning så att filterytorna förblir nedsänkta. Det är bäst att bilden inom en månad. - För optimal bildbehandling, utnyttja Thy1-YFP mus nervceller med en anti-GFP antikroppar för att specifikt fläcka neuronal afferents långt över bakgrundsnivåer. Använd Anti-Neurofilament 200 för att exakt färga axonalstrukturer om Thy1-YFP-möss inte är tillgängliga.
- Bild som önskas. Filter behöver inte pläteras och kan istället placeras ovanpå ett täckslip eller glida för bildbehandling med ett inverterat mikroskop.
Obs: Områden av filtret kommer inte att innehålla brusande strukturer. Ta flera bilder med ett z-stack djup som fångar alla afferent strukturer. Använd sy programvara för att visualisera neurite utväxt över stora områden, eller (helst) hela filterregioner.
- RNA, protein och mediesamling
- Medan transwellfilter bearbetas, samla in media i RNAse/DNAse-fria rör och frysa för senare analyser (ELISA, proteomik osv.).
- Omedelbart efter medieinsamling, aliquot lysis buffert eller Radio Immuno Precipitation Assay (RIPA) buffert med proteinas och fosfatashämmare i brunnarna. Detta protokoll optimerades för 100 μL/brunn i en 24-brunnsplatta.
- Låt buffertar lyseceller i 5 min skrapa sedan varje filter med en ny pipettspets och samla in cellproverna i RNAse/DNAse-fria rör. Frys lysen för framtida analyser (semikvantitativ och/eller kvantitativ PCR, västra blot, etc.).
- Valfri immunfluorescens av tandmassaceller:
- Lyft försiktigt täckglider från avsnitt 1.1 med pincett och överför dem till olika brunnar med 4% PFA för 1 h med gungning.
- Aspirera PFA och skölj täckhalkan två gånger med 1x PBS. Följ detta med permeabilisering, blockering och immunfluorescens för markörer av intresse med standard immunofluorescenstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa resultat visar att TG neurite utväxt ökade i närvaro av primära DP-celler i den underliggande brunnen jämfört med kontrollen av TG neurite monokultur(figur 2A,C). Det finns vissa analys-till-analys variabilitet i neurite utväxt. Således bör en TG neuron monokultur ingå i alla analyser som en kontroll för att upptäcka de basala nivåerna av neurite utväxt. Primära celler från Tgfbr2f/f-musen användes i detta protokoll efter infektion av Ad-Cre-GFP och Ad-eGFP bekräftades i motsvarande antal celler(figur 2D). Ad-eGFP fungerade som en kontroll viral vektor. Ad-Cre-GFP raderade den flankerade genen Tgfbr2, vilket framgår av semikvantitativ PCR(figur 2E). I kulturerna med Transforming growth factor betareceptor 2 (Tgfbr2) borttagning minskade neurite utväxt (Figur 2A-C).
Vi utnyttjade Thy1-YFP mus TG nervceller och färgade dem med en anti-GFP antikroppar som producerade mycket specifika och ljusa bilder av axonal strukturer långt över denna bakgrund, som visas i figur 2. Detta gjorde det möjligt att specifikt färgning av neuronala markörer utan icke-specifik färgning av icke-neuronala celler genom att använda tidigare rapporterade metoder såsom kristallviolett7. De stora porerna i filtren kan autofluoresce och/eller ackumulera sekundära antikroppar och minska precisionen i axonal avbildning (figur 3). Medan Thy1-YFP nervceller med immunofluorescens drastiskt förbättrar imaging, ytterligare bakgrund kan tas bort med automatisk trösklar programvara och sedan kvantifieras. Vi rekommenderar också att utföra immunofluorescens för Neurofilament 200 baserat på våra preliminära resultat (visas inte) samt andra8,9 om Thy1-YFP möss inte är tillgängliga.
Bild 1: En schematisk av musdissekering för att få celler för samkultur. (A)Ett diagram över var du ska skära för att öppna musskallen och lokalisera TG nerver, visas i svart i den sista skildringen. Sax anger var saxen ska sätta in i saxspetsarna för att skära längs de streckade linjerna. (B)En kombinerad darkfield och GFP bild som visar Thy1-YFP + TG nerver inringade i vitt. (C)Dissekerade TG-ganglier kan sedan spridas och odlas, vilket visas i F. (D)Underkäken på en P7-mus, med pincett som håller underkäken till vänster och alveolar benåsar som innehåller unerupted tänder på varje sida av tungan. (E)DP-vävnad (inringad) utvinns ur den mineraliserade strukturen (överst), och emaljyttre epitel (botten) som togs bort för att skingra och platta i en vävnadskulturbehandlad platta, som visas i F. Bilder visas inte skala. DP-celler var spridda och vuxit till sammanflödet innan du lägger TG nervceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativt resultat av samkultur. (A-C) Thy1-YFP TG nervceller odlades i transwell filter med 3 μm porer ovanpå primära Tgfbr2f /f DP celler. Immunofluorescerande färgning utfördes för YFP-proteinet med hjälp av en anti-GFP-antikropp för att ge mycket specifik färgning av neuronala strukturer över hela filtret. De maximala projektionerna på 100 μm z-stack konfokalmikroskopi bilder på 10x samlades in och syddes med sömnad programvara. TG nervceller visat betydligt mer utväxt när samodlade med DP-celler (A) än när odlade ensam (C). Neurite utväxt var inte inducerad när nervceller var co-odlade med DP celler infekterade med Ad-Cre-GFP att slå ner Tgfbr2 (B). Skalstång = 1 000 μm. Motsvarande antal celler infekterade med Ad-eGFP och Ad-Cre-GFP visas i (D). Skalstång = 125 μm. Semikvantitativ PCR bekräftade Tgfbr2 KD (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Tekniska svårigheter presenteras i brusande bildbehandling. (A)Brightfield imaging av transwell filter efter kristallviolett färgning av cellpopulationer. Stora porer är vanliga. Den stora pilen pekar ut en cell som uppvisar mesenchymal morfologi, medan den lilla pilen pekar på en cell av neuronal morfologi. Kristallviolett färgade båda cellerna utan partiskhet. (B)Immunofluorescerande färgning av β3 tubulin med en Alexa-488 sekundär antikropp visade icke-specifik färgning av flera celler, vilket gör avbildning av bfferent strukturer svårt. Bilderna är representativa och upprepades över flera analyser för att optimera avbildningen som visas i figur 2. Skalstång = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Volym | Koncentration | |
| MEM α | 440 ml | ||
| Värme inaktiverad fetala nötkreatur serum | 50 ml | 10% | |
| 100x L-glutamin | 5 ml | 1x (1 x) | |
| Penicillin-streptomycin 100 x | 5 ml | 1x (1 x) | |
| Ändra media dag 2 med mitotiska hämmare vid dessa slutliga koncentrationer | |||
| Uridine (på andra) | 1 μM | ||
| 5'-Fluor-2'deoxyuridine | 15 μm | ||
Tabell 1: Samkulturmedia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dagliga verksamheten i munhålan kräver att tänderna känner yttre stimuli och inre inflammation för att möjliggöra korrekt användning och underhåll. Endast begränsad information finns dock om de signaler som driver de utvecklingsprocesser av tand innervation. Detta protokoll ger en metod för att isolera och samkultur primära DP celler och TG nervceller för att studera tvärkommunikation mellan de två populationerna. Flera variabler optimerades och lämnar öppna ytterligare forskningsvägar, som beskrivs nedan.
Kontroller är viktiga vid varje steg i denna analys. Ett transwellfilter med TG-nervceller utan underliggande DP-celler bör ingå i varje analys för att ge en baslinje för TG-tillväxt. När du tar bort en flankerad gen av intresse med en Ad-Cre-GFP recombinas, ett kontrollvirus som uttrycker endast lysrör sedermera bör användas för att bekräfta att motsvarande antal celler har smittats. Medan vi visade höga nivåer av infektion med minimal celldöd vid 100 och 200 MOI för Ad-eGFP och Ad-Cre-GFP, respektive, varje labb bör optimera detta steg. Eftersom fluorescerande proteiner kan fästas på olika initiativtagare och därför orsaka differentiella uttryck motsvarande antal infekterade, fluorescerande celler bör räknas. Den totala intensiteten i fluorescensen är irrelevant eftersom det inte korrekt återspeglar infektionsstatus. Det är viktigt att visa borttagning av genen, vilket visas med semikvantitativ PCR i detta protokoll (figur 2). Även om detta protokoll inte tog upp detta ämne, visade tidigare forskning att kontrollanalyser med andra celler linjer kan ingå för att visa att neurite utväxt en specifikt framkallas av samkultur med DP-celler8.
Eftersom detta protokoll använder primära celler, det finns flera steg där kontaminering kan införas. För att förhindra detta bör alla reagenser vara sterila filtrerade. Dessutom rekommenderas att experiment för varje variabel körs i duplicera eller tredubblas för att möjliggöra avlägsnande av ett filter och sterilisering av en förorenad brunn utan fullständig fel på analysen.
Täckslar måste beläggas med poly-D-lysin och/eller ett extracellulärt matrisprotein för att säkerställa DP-cellvidhäftningar. Medan cellerna inledningsvis fäster, orsakar virusinfektion celllyft död på obestruket täcke och förhindrar genetisk manipulation av co-kultur analys.
Det är väl etablerat att icke-neuronala celler, såsom Schwann celler från TG ganglierna, kan påverka överlevnaden av neuronala celler i kultur14,15,16. I detta protokoll optimerades neuronal överlevnad genom att lägga till 1 μM uridin och 15 μM 5-fluoro-2'deoxyuridine. Utan tillsats av dessa antimitotiska medel för att hämma Schwann cell spridning, kommer neurite utväxt inte förekommer. Det är okänt om förekomsten av dessa senescent Schwann celler i samkultur ändra neuronal svar. Isolera murin nervceller kräver flera ytterligare steg, och protokoll är tillgängliga för utredare som vill ta bort denna variabel17. I båda fallen, neuron spridning något härmar en axotomy och kan anses representera skada / reparation18 mer än utveckling. Ytterligare studier skulle krävas för att fastställa skillnaderna mellan in vivo axonal tillväxt från fascicles kontra axonal tillväxt från enskilda nervceller in vitro, och dessa behandlas inte i detta protokoll.
Det här protokollet tar 1-3 veckor från början till. Även om det är möjligt att använda DP-celler som kräver mer än 1 vecka för att nå 85-90% sammanflödet, rekommenderas att celler sås med en tillräckligt hög densitet för att nå sammanflödet inom några dagar eftersom dessa celler delar sig mycket långsamt förbi den punkten. Detta kräver i allmänhet cirka 5-7 P5-8 möss per rad av en 24-brunn sett. Detta protokoll var optimerat för totalt 5 dagar av samkultur, då media med fenol rött började flytta färg. Media bör ändras om längre analyser önskas.
Flera samkulturanalyser har utförts för att demonstrera neurite utväxt som svar på faktorer som utsöndras av DP utsöndrade faktorer med standard ECM-belagda vävnadsodlingsplattor3,19,20,21 eller mikrofluidiska kammare8,22,23. Detta protokoll ger flera fördelar jämfört med dessa metoder. TG-ganglierna och DP-vävnadssamkulturen kräver till exempel ett specifikt rumsligt förhållande för neurites att känna av och reagera på kortdistansparacinsignaler. Med organkultur, endast neurites i ganglier närmast DP vävnaden kan svara3, medan spridda TG nervceller som används i detta protokoll är odlade på ett lika avstånd från DP celler under. För det andra kan organkulturer införa vävnadnekros på grund av bristen på syre och näringsämnen som finns i stora prover24. Samkulturen av spridda celler tar bort denna möjlighet. Vissa co-kulturer inklusive nervceller kräver neuronal media3,22 som kan spela en dominerande roll för att främja neurite utväxt. Detta protokoll lägger inte till neuronspecifika tillväxtfaktorer, vilket möjliggör en utvärdering av det direkta förhållandet mellan paracrine signaler från de underliggande DP-cellerna och neurite utväxt svar. Det är värt att notera att samkulturmedia också saknar komponenter för att främja mineralisering, såsom beta-glycerophosfat. Detta gör det möjligt för utredare att avgöra hur neurites kan utsöndra signaler för att uppmuntra mineralisering. Emellertid begränsar det också studien, genom att endast inklusive mindre-differentiated DP-celler utan mineralisera odontoblasts som vanligt är närvarande in vivo.
Kolorimetriska svar från tidigare forskning7,8 inte avgränsa Schwann cell bidrag eller visa neuronal morfologi eftersom kristallviolett icke-specifikt fläckar alla celler. Immunofluorescerande färgning av filter kan resultera i höga bakgrundsnivåer som gör afferent imaging svårt(figur 2). Det nuvarande protokollet möjliggör exakt färgning av neuronal afferents genom att använda Thy1-YFP TG nervceller och en anti-GFP antikropp och ger en signal tillräckligt ljus för att generera stora bilder av tillväxt under en hel figur(figur 3). Det är möjligt att använda andra neuronala markörer, såsom Anti-Neurofilament 200, om Thy1-YFP möss inte är tillgängliga.
Slutligen, med hjälp av primära DP-celler från möss med gener av intresse flankerad av loxP-platser möjliggör enkel och effektiv borttagning av dessa gener med en Ad-Cre-GFP-system. I framtida studier, Ad-Cre rekombinassystemet kan användas på TG nervceller om de har en gen av intresse flankerad av loxP platser. Detta skulle underlätta studier om hur paracrine signaler från neuronal befolkningen påverkar DP-celler, särskilt om DP-cellerna är seedade ovanpå täckhalka (avsnitt 1.1). Framtida studier kan utnyttja andra manipulationer, såsom tillsats av farmakologiska hämmare och/eller tillväxtfaktorer. Det är också möjligt att ändra detta protokoll till att omfatta migreringsstudier med hjälp av 8 μm porositettranswellfilter.
Sammanfattningsvis möjliggör denna transwell-samkulturanalys som använder nervceller och DP-celler för undersökning av flera cellulära parametrar. Detta gör det möjligt att bredda kroppen av kunskap om mesenchymal-neuronal interaktioner som främjar och stöder tand innervation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av a) National Institutes of Health / NIAMS (bidragsnummer R01 AR062507 och R01 AR053860 till RS), b) University of Alabama vid Birmingham Dental Academic Research Training (DART) bidrag (nummer T90DE222736 (PI MacDougall)) till SBP från National Institute of Dental and Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) En UAB Global Center for Craniofacial, orala och tandsjukdomar (GC-CODED) Pilot och genomförbarhetsbidrag till SBP och d) National Institute of Dental och Craniofacial Forsknings-/nationella hälsoinstitut K99 DE024406 bevilja sbp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
