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Summary
Abstract
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Immunology and Infection

मापने एरिथ्रोसाइट पूरक रिसेप्टर 1 प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

इस विधि का उद्देश्य तीन विषयों जिनके एरिथ्रोसाइट CR1 घनत्व ज्ञात है के साथ तुलना करके किसी भी विषय के erythrocytes में CR1 घनत्व निर्धारित करना है । विधि एक विरोधी CR1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा विषयों के एरिथ्रोसाइट्स के इम्यूनोस्टेनिंग के बाद फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करती है, जो फिकोरिथ्रिन (पीई) का उपयोग करके एक प्रवर्धित प्रणाली के साथ मिलकर होती है।

Abstract

CR1 (CD35, C3b/C4b के लिए पूरक रिसेप्टर प्रकार 1) लगभग 200 केडीए का एक उच्च आणविक वजन झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन है जो पूरक सक्रियण को नियंत्रित करता है, प्रतिरक्षा परिसरों का परिवहन करता है, और विनोदी और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भाग लेता है। CR1 एरिथ्रोसाइट्स सहित कई सेल प्रकारों की सतह पर मौजूद है, और लंबाई, संरचना (Knops, या KNps, रक्त समूह), और घनत्व में बहुरूपता प्रदर्शित करता है । सीआर1 प्रति एरिथ्रोसाइट (सीआर1/ई) का औसत घनत्व प्रति एरिथ्रोसाइट 500 अणु है। यह घनत्व एक व्यक्ति से दूसरे (100-1,200 CR1/E) में भिन्न होता है और एक ही व्यक्ति में एक एरिथ्रोसाइट से दूसरे में होता है । हम यहां CR1/E के घनत्व को मापने के लिए एक मजबूत प्रवाह साइटोमेट्री विधि प्रस्तुत करते हैं, जिसमें कम घनत्व व्यक्त करने वाले विषयों में, एक बढ़ाना इम्यूनोस्टेनिंग सिस्टम की मदद से शामिल है । इस विधि ने हमें अल्जाइमर रोग (विज्ञापन), प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमाटोस (एसएलई), एड्स या मलेरिया जैसे रोगों में CR1 एरिथ्रोसाइट अभिव्यक्ति को कम करने में सक्षम बनाया है।

Introduction

CR1 (पूरक रिसेप्टर प्रकार 1, CD35) कई कोशिका प्रकारों की सतह पर मौजूद 200 केडीए ट्रांसमेम्ब्रेनग्कोप्रोटीन है, जैसे एरिथ्रोसाइट्स1,बी लिम्फोसाइट्स2,मोनोसाइटिक कोशिकाएं, कुछ टी कोशिकाएं, फोपल्युलर डेंड्रिटिक कोशिकाएं3,भ्रूण एस्ट्रोसाइट्स4,और ग्लोमेरिकुलर पोडोसाइट्स5। CR1 अपने लिगांड्स C3b, C4b, C3bi6,,7,,8,,9,पहले पूरक घटक, C1q10 और एमबीएल (मन्नान-बाध्यकारी लेक्टिन)11 के साथ हस्तक्षेप पूरक की सक्रियता को रोकता है और विनोदी और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल है ।

मनुष्यों सहित वानरों में, एरिथ्रोसाइट सीआरएफ 1 प्रतिरक्षा परिसरों के यकृत और तिल्ली तक परिवहन में शामिल है, ताकि रक्त को शुद्ध किया जा सके और त्वचा या गुर्दे12,,13,,14जैसे कमजोर ऊतकों में उनके संचय को रोका जा सके। प्रतिरक्षा परिसरों और एरिथ्रोसाइट्स के बीच प्रतिरक्षा आसंजन की यह घटना सीआर 1 अणुओं की संख्या15पर निर्भर करती है । मनुष्यों में, CR1/E का औसत घनत्व केवल 500 (यानी, सीआर 1 प्रति एरिथ्रोसाइट के 500 अणु) है। यह घनत्व एक व्यक्ति से दूसरे (100-1,200 CR1/E) में भिन्न होता है और एक ही व्यक्ति में एक एरिथ्रोसाइट से दूसरे में होता है । “नल” फेनोटाइप एक्सप्रेस के कुछ व्यक्तियों से कम 20 CR1/E16।

CR1*E के घनत्व को सीआर 1 * 117,,18के लिए जीन कोडिंग के इंट्रॉन 27 में एक बिंदु उत्परिवर्तन से जुड़े दो सह-प्रमुख ऑटोसोमल एलील्स द्वारा विनियमित किया जाता है । यह उत्परिवर्तन हिंडIII एंजाइम के लिए एक अतिरिक्त प्रतिबंध साइट का उत्पादन करता है। इस मामले में हिंडIII के साथ पाचन के बाद प्राप्त प्रतिबंध टुकड़े सीआर 1 (एच: उच्च एलील) की एक मजबूत अभिव्यक्ति से जुड़े एलील के लिए 7.4 केबी और कम CR1 अभिव्यक्ति (एल: कम एलील) से जुड़े एलील के लिए 6.9 केबी हैं। यह लिंक कोकेशियान और एशियाइयों में पाया जाता है लेकिन अफ्रीकी मूल के लोगों में नहीं19।

एरिथ्रोसाइट सीआरएफ 1 की अभिव्यक्ति का स्तर एक्सोन 13 एन्कोडिंग स्सीआर 10 (I643T) में पॉइंट न्यूक्लियोटाइड म्यूटेशन की उपस्थिति और एक्सॉन 19 एन्कोडिंग SCR16 (Q981H) में भी सहसंबद्ध है। यह होमोज़िगौस 643I/981Q में उच्च और होमोज़िगौस 643T/981H व्यक्तियों20में कम है । इस प्रकार, “कम” व्यक्तियों के आसपास व्यक्त १५० CR1/E, “मध्यम” व्यक्तियों के आसपास व्यक्त ५०० CR1/E, और “उच्च” व्यक्तियों के आसपास व्यक्त १,००० CR1/E ।

इस एरिथ्रोसाइट घनत्व बहुरूपता के अलावा, सीआर 1 को विभिन्न आकारों के चार एलोटाइप के अनुरूप लंबाई बहुरूपता की विशेषता है: CR1*1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), और CR1*4 (250 kDa)21 और एक एंटीजेनिक बहुरूपता समूह केएन22 केअनुरूप।

हम तीन विषयों जिसका CR1/E घनत्व जाना जाता है का उपयोग कर के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के आधार पर हमारी विधि पेश करते हैं, एक कम घनत्व स्तर (१८० CR1/E), एक मध्यम घनत्व स्तर (६४६ CR1/E), और एक उच्च घनत्व स्तर (९६६ CR1/E) व्यक्त करते हुए, यह उनके एरिथ्रोसाइट्स या लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी), या आरबीसी MFI के मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) को मापने के लिए आसान है, एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर के बाद । एक तो एक मानक CR1/E घनत्व के एक समारोह के रूप में एमएफआई का प्रतिनिधित्व लाइन की साजिश कर सकते हैं । जिन विषयों के CR1/E घनत्व का ज्ञात नहीं है और इसमानक लाइन से इसकी तुलना कर रहे हैं, उनविषयों के एमएफआई को मापने के लिए व्यक्तियों के CR1/E घनत्व का निर्धारण करना संभव है । इस तकनीक का उपयोग प्रयोगशाला में कई वर्षों से किया गया है, और इसने हमें कई विकृतियों जैसे सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेटोस (एसएलई)23,अधिग्रहीत इम्यूनोडेफिशिएंसी सिंड्रोम (एड्स)24,मलेरिया25और हाल ही में अल्जाइमर रोग (ईडी)26, 27,27जैसी कई विकृतियों में एरिथ्रोसाइट CR1 की अभिव्यक्ति में कमी का पता लगाने में सक्षम बनाया है। सीआर1 को एरिथ्रोसाइट्स के साथ जोड़े को लक्षित करने वाली दवाओं के विकास के लिए, जैसा कि एंटी थ्रोम्बोटिक दवाओं के मामले में28 को CR1/E घनत्व के मूल्यांकन और CR1 की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत तकनीक की उपलब्धता की आवश्यकता है ।

प्रोटोकॉल गायन में रन प्रस्तुत किया । यह विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग कर के कई व्यक्तियों पर CR1/E के घनत्व का निर्धारण करने के लिए अनुकूलनीय है (सामग्री की तालिकादेखें) । इस उद्देश्य के लिए, किसी भी 96 अच्छी प्लेट के लिए हमारी विधि को अनुकूलित करना आसान है। प्रत्येक नमूने के लिए, एरिथ्रोसाइट्स (0.5 x 106-1 x 106 एरिथ्रोसाइट्स) का सेल निलंबन प्रति अच्छी तरह से वितरित किया जाता है। प्रत्येक अच्छी तरह से, पहले प्राथमिक विरोधी CR1 एंटीबॉडी जोड़ा जाता है, फिर स्ट्रेप्टाविडिन पीई, माध्यमिक विरोधी स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी, और फिर स्ट्रेप्टाविडिन पीई, हमारी विधि के समान कमजोर होने का उपयोग करके, लेकिन मात्रा को अनुकूलित करके और समानता का सम्मान करके।

सीमा के विषयों से और CR1 के लिए मात्रा निर्धारित किए जाने वाले विषयों से रक्त के नमूनों को एक ही समय में खींचा जाना चाहिए, फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, और 4 डिग्री सेल्सियस (बर्फ पर और/या रेफ्रिजरेटर में) पर संभाला जाना चाहिए।

Protocol

मानव रक्त संग्रह और हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और क्षेत्रीय आचार समिति (सीपीपी एस्ट द्वितीय) द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रोटोकॉल संख्या 2011-A00594-37 है । क्योंकि निम्नलिखित प्रोटोकॉल म?…

Representative Results

तीन विषयों के एरिथ्रोसाइट्स जिनके CR1 का घनत्व ज्ञात है (“कम” विषय [180 CR1/E], “मध्यम” विषय [६४६ CR1/E], और “उच्च” विषय [९६६ CR1/E]), और दो विषयों जिनके CR1 घनत्व निर्धारित करने की जरूरत थी एक विरोधी CR1 एंटीबॉडी द्वारा एक प्रवर्ध?…

Discussion

एरिथ्रोसाइट CR1 (CR1/E) के घनत्व को निर्धारित करने के लिए कई तकनीकें उपलब्ध हैं । पहली तकनीकों का उपयोग एंटी-सीआर1 एंटीबॉडी31 द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं का एग्गेटिनेशन और सी 3 बी32के साथ लेपित ए?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम यूआरसीएसाइट, फ्लो साइटोमेट्री टेक्निकल प्लेटफॉर्म, इम्यूनोलॉजी विभाग के कर्मचारियों और इंटरनल मेडिसिन एंड जेरियाट्रिक्स विभाग के स्टाफ के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, जिन्होंने प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने और मान्य करने में योगदान दिया । इस काम को रिम्स विश्वविद्यालय अस्पतालों (अनुदान संख्या AOL11UF9156) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
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Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
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