JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Måle Erytrocytt Komplement reseptor 1 ved hjelp av flow cytometri

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Målet med denne metoden er å bestemme CR1 tetthet i erytrocytter av ethvert emne ved å sammenligne med tre hvis erytrocytt CR1 tetthet er kjent. Metoden bruker flow cytometri etter immunfarging av forsøkspersonenes erytrocytter av et anti-CR1 monoklonalt antistoff koblet til et forsterket system ved hjelp av phycoerythrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) er en høy molekylvekt membran glykoprotein på ca 200 kDa som styrer komplement aktivering, transporterer immunkomplekser, og deltar i humoral og cellulær immunresponser. CR1 er til stede på overflaten av mange celletyper, inkludert erytrocytter, og viser polymorfismer i lengde, struktur (Knops, eller KN, blodgruppe) og tetthet. Den gjennomsnittlige tettheten av CR1 per erytrocytt (CR1/E) er 500 molekyler per erytrocytt. Denne tettheten varierer fra ett individ til en annen (100–1200 CR1/E) og fra en erytrocytt til en annen i samme person. Vi presenterer her en robust flytcytometrimetode for å måle tettheten av CR1/E, inkludert hos personer som uttrykker lav tetthet, ved hjelp av et forsterkende immunfargingssystem. Denne metoden har gjort oss i stand til å vise senking av CR1 erytrocytt uttrykk i sykdommer som Alzheimers sykdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), AIDS, eller malaria.

Introduction

CR1 (komplement reseptor type 1, CD35) er en 200 kDa transmembrane glykoprotein tilstede på overflaten av mange celletyper, for eksempel erytrocytter1, B lymfocytter2, monocytiske celler, noen T-celler, follikulære dendrittiske celler3, fosterastrocytter4, og glomerulære podocytes5. CR1 forstyrrer sin ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, en underenhet av den første komplementkomponenten, C1q10 og MBL (mannanbindende lectin)11 hemmer aktiveringen av komplement og er involvert i humoral og cellulær immunrespons.

I primater, inkludert mennesker, erytrocytt CR1 involvert i transport av immunkomplekser til lever en og milt, for å rense blodet og forhindre akkumulering i sårbare vev som hud eller nyrer12,13,14. Dette fenomenet immunvedhesjon mellom immunkomplekser og erytrocytter avhenger av antall CR1 molekyler15. Hos mennesker er gjennomsnittlig tetthet av CR1/E bare 500 (dvs. 500 molekyler av CR1 per erytrocytt). Denne tettheten varierer fra ett individ til en annen (100–1200 CR1/E) og fra en erytrocytt til en annen i samme person. Noen individer av “null” fenotype uttrykker færre enn 20 CR1/E16.

Tettheten av CR1/E reguleres av to co-dominerende autosomale alleler knyttet til en punktmutasjon i intron 27 av genkodingen for CR1 * 117,18. Denne mutasjonen gir et ekstra restriksjonssted for HindIII-enzymet. Begrensningsfragmentene oppnådd etter fordøyelsen med HindIII i dette tilfellet er 7,4 kb for allelen knyttet til et sterkt uttrykk for CR1 (H: høy allele) og 6,9 kb for allelen knyttet til lavt CR1-uttrykk (L: lav allele). Denne linken finnes i kaukasiere og asiater, men ikke hos personer av afrikansk avstamning19.

Uttrykket av erytrocytt CR1 er også korrelert med tilstedeværelsen av punkt nukleotid mutasjoner i exon 13 koding SCR 10 (I643T) og i exon 19 koding SCR16 (Q981H). Det er høyt i homozygot 643I/981Q og lav i homozygot 643T/981H individer20. Dermed uttrykker “lave” individer rundt 150 CR1 / E, “medium” individer uttrykker rundt 500 CR1 / E, og “høye” individer uttrykker rundt 1000 CR1 / E.

I tillegg til denne erytrocytttettheten polymorfisme, er CR1 preget av en lengde polymorfisme som tilsvarer fire allotyper av forskjellige størrelser: CR1* 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), og CR1 * 4 (250 kDa)21 og en antigen polymorfisme tilsvarende blodgruppen KN22.

Vi presenterer vår metode basert på flow cytometri for å bestemme tettheten av CR1 /E. Ved hjelp av tre med CR1/E tetthet er kjent, uttrykker et lavt tetthetsnivå (180 CR1/E), et middels tetthetsnivå (646 CR1/E) og et høyt tetthetsnivå (966 CR1/E), er det lett å måle gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av deres erytrocytter eller røde blodlegemer (RBC), eller RBC MFI, etter anti-CR1 immunfarging ved hjelp av et strømningscytometer. Man kan deretter tegne en standardlinje som representerer MFI som en funksjon av CR1/E-tetthet. Måling av MFI av personer med CR1/E tetthet ikke er kjent og sammenligne den med denne standardlinjen, er det mulig å bestemme individets CR1/E tetthet. Denne teknikken har blitt brukt i mange år i laboratoriet, og har gjort oss i stand til å oppdage en reduksjon i uttrykket av erytrocytt CR1 i mange patologier som systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Ervervet immunsvikt syndrom (AIDS)24, malaria25, og nylig Alzheimers sykdom (AD)26,27. Utviklingen av legemidler rettet mot CR1 til par med erytrocytter, som i tilfelle av antitrombotiske legemidler28 krever evaluering av CR1 / E tetthet, og tilgjengeligheten av en robust teknikk for å kvantifisere CR1.

Protokollen som presenteres går i singlicate. Det kan tilpasses til å bestemme tettheten av CR1/E på mange personer som bruker spesifikke kommersielt tilgjengelige 96 brønnplater (se Materialtabellen). For dette formål er det lett å tilpasse vår metode til en hvilken som helst 96 brønnplate. For hver prøve fordeles en cellesuspensjon av erytrocytter (0,5 x 106–1 x 106 erytrocytter) per brønn. For hver brønn, først den primære anti-CR1 antistoff legges til, deretter streptavidin PE, sekundær anti-streptavidin antistoff, og igjen streptavidin PE, ved hjelp av de samme fortynninger som de av vår metode, men ved å tilpasse volumer og respektere proporsjonalitet.

Blodprøvene fra personer i området og fra forsøkspersoner som skal kvantifiseres for CR1 skal trekkes samtidig, oppbevares i kjøleskapet ved 4 °C, og håndteres ved 4 °C (på is og/eller i kjøleskapet).

Protocol

Protokollen for innsamling og håndtering av menneskelig blod ble gjennomgått og godkjent av den regionale etikkkomiteen (CPP Est II), og protokollnummeret er 2011-A00594-37. Fordi følgende protokoll beskriver håndteringen av menneskelig blod, bør institusjonelle retningslinjer for avhending av biologisk farlig materiale følges. Laboratoriesikkerhetsutstyr, som laboratoriefrakker og hansker, bør brukes. 1. Erytrocyttvask MERK: Dagen før håndtering, klargjør e…

Representative Results

Erytrocytter av tre forsøkspersoner hvis tetthet av CR1 er kjent (“lav” subjekt [180 CR1/E], “medium” subjektet [646 CR1/E], og “høy” motiv [966 CR1/E]), og av to personer hvis CR1 tetthet måtte bestemmes ble immunisert av et anti-CR1 antistoff koblet til et forsterkningssystem ved hjelp av fycoerythrinfluorochrome. I begynnelsen ble CR1-tettheten til forsøkspersonene fra det lave høyområdet bestemt av Scatchard-metoden29 ved hjelp av radiomerkede antistoffer. Standardene (lav, middels og h?…

Discussion

Flere teknikker er tilgjengelige for å bestemme tettheten av erytrocytt CR1 (CR1/E). De første teknikkene som ble brukt var agglutinering av røde blodlegemer ved anti-CR1 antistoffer31 og dannelsen av rosetter i nærvær av erytrocytter belagt med C3b32. Disse rudimentære teknikkene ble raskt erstattet av immunflekker metoder ved hjelp av radiomerkede anti-CR1 antistoffer1,33. Det er også mulig å måle konsent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmene av URCACyt, flow cytometri teknisk plattform, de ansatte ved Department of Immunology, og de ansatte ved Institutt for indremedisin og geriatriske, som bidro til å optimalisere og validere protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av Reims Universitetssykehus (stipendnummer AOL11UF9156).

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer’s Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

Keywords: ErythrocyteComplement Receptor 1Flow CytometryCell Receptor DensityImmunostainingBiotinylated AntibodyStreptavidin Phycoerythrin
check_url/60810?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image