JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Mätning Erytrocyt Komplement Receptor 1 Med hjälp av Flow Cytometry

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Syftet med denna metod är att bestämma CR1 densitet i erytrocyter av något ämne genom att jämföra med tre ämnen vars erytrocyt CR1 densitet är känd. Metoden använder flödescytometri efter immunfärgning av försökspersonernas erytrocyter genom en anti-CR1 monoklonal antikropp kopplad till ett förstärkt system med fykoerytrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor typ 1 för C3b/C4b) är ett högmolekylmembran glykoprotein på ca 200 kDa som styr komplementaktivering, transporterar immunkomplex och deltar i humorala och cellulära immunsvar. CR1 finns på ytan av många celltyper, inklusive erytrocyter, och uppvisar polymorfismer i längd, struktur (Knops, eller KN, blodgrupp), och densitet. Den genomsnittliga tätheten av CR1 per erytrocyt (CR1/E) är 500 molekyler per erytrocyt. Denna densitet varierar från en individ till en annan (100–1 200 CR1/E) och från en erytrocyt till en annan i samma individ. Vi presenterar här en robust flöde cytometri metod för att mäta densiteten av CR1/E, inklusive i ämnen som uttrycker en låg densitet, med hjälp av en förstärkande immunstainning system. Denna metod har gjort det möjligt för oss att visa sänkning av CR1 erytrocyt uttryck vid sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), aids, eller malaria.

Introduction

CR1 (komplementreceptor typ 1, CD35) är en 200 kDa transmembrane glykoprotein som finns på ytan av många celltyper, såsom erytrocyter1, B lymfocyter2, monocytiska celler, vissa T-celler, follikulära dendritiska celler3, fetala astrocyter4, och glomerular podocyter5. CR1 störa dess ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, en underenhet av den första komplement komponenten, C1q10 och MBL (mannan-bindande lectin)11 hämmar aktivering av komplement och är involverad i humorala och cellulära immunsvar.

Hos primater, inklusive människor, erytrocyt CR1 är involverad i transport av immunkomplex till levern och mjälte, för att rena blodet och förhindra deras ackumulering i sårbara vävnader såsom hud eller njurar12,13,14. Detta fenomen av immun vidhäftning mellan immunkomplex och erytrocyter beror på antalet CR1-molekyler15. Hos människa är medeltätheten av CR1/E endast 500 (dvs. 500 molekyler av CR1 per erytrocyt). Denna densitet varierar från en individ till en annan (100–1 200 CR1/E) och från en erytrocyt till en annan i samma individ. Vissa individer av “null” fenotyp uttrycka färre än 20 CR1/E16.

Densiteten hos CR1/E regleras av två samdominerande autosomala alleler kopplade till en punktmutation i intron 27 av genkodningen för CR1*117,18. Denna mutation producerar en ytterligare begränsning webbplats för hindIII enzymet. Begränsningen fragment erhålls efter matsmältningen med HindIII i detta fall är 7,4 kb för allel kopplade till ett starkt uttryck för CR1 (H: hög allel) och 6,9 kb för allelen kopplade till låg CR1 uttryck (L: låg allel). Denna länk finns i Kaukasier och asiater men inte i människor av afrikansk härkomst19.

Nivån av uttryck för erytrocyt CR1 är också korrelerad med förekomsten av punkt nukleotid mutationer i exon 13 kodning SCR 10 (I643T) och i exon 19 kodning SCR16 (Q981H). Det är hög i homozygous 643I/981Q och låg i homozygous 643T/981H individer20. Således uttrycker “låga” individer runt 150 CR1/E, “medium” individer uttrycka runt 500 CR1/E, och “höga” individer uttrycka runt 1000 CR1/E.

Utöver denna erytrocyttäthet polymorfism, CR1 kännetecknas av en längd polymorfism som motsvarar fyra allotyper av olika storlekar: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), och CR1 * 4 (250 kDa)21 och en antigen polymorfism som motsvarar blodgruppen KN22.

Vi presenterar vår metod baserad på flödescytometri för att bestämma densiteten hos CR1/E. Med hjälp av tre försökspersoner vars CR1/E-densitet är känd, uttrycker en låg densitetsnivå (180 CR1/E), en medeldensitetsnivå (646 CR1/E) och en hög densitetsnivå (966 CR1/E), är det lätt att mäta medelfluoresintensiteten (MFI) för deras erytrocyter eller röda blodkroppar (RBC) eller RBC MFI, efter anti-CR1-immunstämmande med hjälp av en flödescytometer. Man kan sedan rita en standardlinje som representerar MFI som en funktion av CR1/E densitet. Genom att mäta MFI för försökspersoner vars CR1/E-densitet inte är känd och jämföra den med denna standardlinje är det möjligt att bestämma individernas CR1/E-densitet. Denna teknik har använts i många år i laboratoriet, och har gjort det möjligt för oss att upptäcka en minskning av uttrycket av erytrocyt CR1 i många patologier såsom systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Förvärvade immunbristsyndrom (AIDS)24, malaria25, och nyligen Alzheimers sjukdom (AD)26,27. Utvecklingen av läkemedel som riktar CR1 till par med erytrocyter, som i fallet med anti-trombotiska läkemedel28 kräver utvärdering av CR1/E densitet, och tillgången på en robust teknik för att kvantifiera CR1.

Det protokoll som presenteras körs i singlicate. Det är anpassningsbart att bestämma densiteten hos CR1/E på många individer med hjälp av specifika kommersiellt tillgängliga 96 brunnsplattor (se Tabell över material). För detta ändamål är det lätt att anpassa vår metod till någon 96 brunnsplatta. För varje prov fördelas en cellupphängning av erytrocyter (0,5 x 106–1x 106 erytrocyter) per brunn. För varje brunn tillsätts först den primära anti-CR1-antikroppen, sedan streptavidin PE, den sekundära anti-streptavidin antikroppen och återigen streptavidin PE, med samma utspädningar som vår metod, men genom att anpassa volymer och respektera proportionalitet.

Blodproverna från försökspersoner i intervallet och från försökspersoner som ska kvantifieras för CR1 bör tas samtidigt, förvaras i kylskåp vid 4 °C och hanteras vid 4 °C (på is och/eller i kylskåp).

Protocol

Protokollet för insamling och hantering av humant blod granskades och godkändes av den regionala etikkommittén (CPP Est II), och protokollnumret är 2011-A00594-37. Eftersom följande protokoll beskriver hanteringen av humant blod, bör institutionella riktlinjer för bortskaffande av biohazardous material följas. Laboratoriesäkerhetsutrustning, såsom labbrockar och handskar, bör bäras. 1. Erytrocyt tvätt OBS: Dagen före hantering, bered en PBS-BSA-buffert m…

Representative Results

Erytrocyterna för tre försökspersoner vars densitet av CR1 är känd (“låg” subjekt [180 CR1/E], “medium” ämne [646 CR1/E] och “hög” ämne [966 CR1/E]), och av två ämnen vars CR1 densitet behövde fastställas var immunostained av en anti-CR1 antikropp kopplad till ett förstärkningssystem med hjälp av phycoerythrin fluorochrome. I början bestämdes CR1-densiteten hos försökspersonerna från det låghöga intervallet av Scatchardmetoden29 med hjälp av radiomärkta antikroppar. De sta…

Discussion

Flera tekniker finns tillgängliga för att bestämma densiteten av erytrocyt CR1 (CR1/E). De första tekniker som användes var agglutination av röda blodkroppar av anti-CR1 antikroppar31 och bildandet av rosetter i närvaro av erytrocyter belagda med C3b32. Dessa rudimentära tekniker ersattes snabbt av immunfärgningsmetoder med radiomärkta anti-CR1-antikroppar1,33. Det är också möjligt att mäta koncentrati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar alla medlemmar i URCACyt, flöde cytometri teknisk plattform, personalen vid institutionen för immunologi, och personalen vid institutionen för internmedicin och geriatrik, som bidragit till att optimera och validera protokollet. Detta arbete finansierades av Reims Universitetssjukhus (bidragsnummer AOL11UF9156).

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer’s Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

Keywords: ErythrocyteComplement Receptor 1Flow CytometryCell Receptor DensityImmunostainingBiotinylated AntibodyStreptavidin Phycoerythrin
check_url/60810?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image