Formålet med denne protokol er at vurdere, om forskellige kunstige tåreformuleringer kan beskytte humane hornhinde epitelceller mod udtørring ved hjælp af en in vitro-model. Efter udsættelse for kunstige tåreformuleringer og udtørring vurderes humane hornhinde epitelceller for metabolisk aktivitet.
Kunstig lipid-holdige tåre formuleringer er udviklet til at reducere tåre fordampning ved restaurering af en mangelfuld tåre lipid lag. Kunstige tåreformuleringer, der forhindrer celleaftørring, vil resultere i okulær overfladebeskyttelse og vedligeholdelse af cellemetabolisk aktivitet. Under dehydrering gennemgår celler processen med tab af metabolisk aktivitet og efterfølgende celledød. Dette arbejde beskriver en metode til vurdering af effekten af kunstige tåreformuleringer. Det metaboliske farvestof (dvs. alamarBlue) skifter fra et lavt fluorescerende molekyle resazurin til et fluorescerende molekyle resorufin i levedygtige celler. Den biologiske ydeevne af en kunstig tåre formulering måles som evnen til formuleringen til (a) opretholde celle levedygtighed og (b) give cellebeskyttelse mod udtørring. Vækstmedier og saltvand bruges som styringer til celledygtigheds-/udtørringstestene. Celler inkuberes med testopløsninger i 30 minutter og udtørres derefter i 0 eller 5 min ved 37 °C og 45% relativ luftfugtighed. Cellemetabolisk aktivitet efter første eksponering og efter celleaftørring bestemmes derefter. Resultaterne viser de komparative virkninger af øjendråbeformuleringer på cellemetabolisk aktivitet og udtørringsbeskyttelse. Denne metode kan bruges til at teste tørre øjenformuleringer, der er designet til at behandle personer med fordampningstørt øje.
Mange forskellige ingredienser i fleredosis oftalmiske opløsninger er nødvendige for at opretholde stabilitet, pH, osmolaritet og effektivitet. Nogle kemikalier såsom konserveringsmidler eller overfladeaktive stoffer i okulære opløsninger kan dog forårsage skade på hornhindeepitelet1,2. Celle levedygtighed test ved hjælp af humane hornhinde epitelceller (HCEC) kan udføres for at vurdere de potentielle skader forårsaget af disse forskellige ingredienser i oftalmiske formuleringer. En af de in vitro-assays, der er særligt nyttige til vurdering af celleskader, er alamarBlue-analysen3. I denne analyse indeholder det metaboliske farvestof (dvs. alamarBlue) resazurin, der fungerer som en celles levedygtighedsindikator. Under cellulært åndedræt reduceres resazurin til resorufin ved at acceptere elektroner4. Reduktionen af resorufin forårsager en ændring fra et ikke-fluorescerende molekyle til et fluorescerende molekyle, der kan påvises ved hjælp af et spektrofluorometer5.
Denne undersøgelse bruger to forskellige behandlinger af hornhinde epitelceller til at bestemme, hvordan tørre øjne produkter kan udføre i en in vitro model. I den første evaluering behandles cellerne med disse produkter i 30 minutter. Efter behandling evalueres cellerne derefter for metabolisk aktivitet umiddelbart efter eksponering for tørre øjenprodukter og efter et restitutionstidsinterval. Denne vurdering bestemmer virkningen af disse produkter på celler før udtørring i et fugtighedskammer. Opløsningsbeskyttelsesmidler, overfladeaktive stoffer eller buffere i disse opløsninger kan have nogle cytotoksiske virkninger på cellerne, der kan påvises ved hjælp af det metaboliske farvestof.
Den anden evaluering bestemmer cellernes metaboliske aktivitet efter eksponering for tørre øjenprodukter og udtørring. Hvis produktbehandlingen i denne vurdering yder cellerne beskyttelse mod udtørringsskader, vil cellernes metaboliske aktivitet blive opretholdt. Cellebeskyttelse mod de skadelige virkninger af udtørring kan forekomme, hvis tørøjeproduktet kan belægge cellerne med lipider, eller produktet kan absorbere væske fra omgivelserne, der tilføjer fugt til cellerne.
Denne protokol er designet til at simulere alvorlige tilstande af miljøbelastning på celler. Andre undersøgelser har brugt forskellige modeller til at skabe denne eksterne stress. Nogle undersøgelser har tørret cellerne i laminar flow emhætter6,7,8, mens andre har brugt stuetemperatur og forskellige relative fugtighed (RH) værdier9,10,11. En metode til simulering af tørre øjenlidelser er at øge osmolariteten af inkubationsopløsningen12,13. En anden in vitro-metode til simulering af ugunstige miljøforhold er at tilføje cytokiner til cellemediet for at simulere tårevæsken hos patienter med tørre øjne14. Selvom disse tests er interessante modeller, der kan evaluere, hvordan kemikalier reducerer osmotisk stress eller stimulerer immunsystemet, viser disse modeller ikke direkte, hvordan kemiske formuleringer kan beskytte celler mod udtørringsstress.
Udtørringsmodellen bruger et temperatur-/fugtighedskammer 37 °C og 45% RH. Det simulerer miljøforhold, der kan forårsage fordampning fra okulær overflade. Simuleringer af andre ekstreme miljøforhold såsom lav luftfugtighed findes i flykabiner15 eller i indendørs miljøer i vintermånederne16 kan også udføres ved hjælp af denne metode.
Cellekultur modellering bruges til at simulere effekten af udtørring stress på den menneskelige hornhinde. For at detektere cellestress udføres der celledygtighedstest for at bestemme indvirkningen på cellesundheden. Flere forskellige fysiologiske tests kan udføres på celler for at afgøre, om de er stressede17. Den analyse, der udføres i denne testprocedure, anvender det kommercielt tilgængelige metaboliske farvestof (Tabel over materialer). Det har den fordel i forhold til mange andre celle stresstest i, at det er ikke-giftige, opløselige i vækst medier og kan evaluere celler uden celle fiksering18. I denne procedure testes cellerne for metabolisk aktivitet umiddelbart efter hver behandling, og et andet sæt celler placeres tilbage i vækstmedier og evalueres efter 18 timers genopretning. Årsagen til test straks og derefter efter en genopretningsperiode er at identificere celleskader, der forårsager øjeblikkelige virkninger på metabolisk aktivitet og celleskader, der forårsager forsinkede virkninger. Det giver også mulighed for at evaluere virkningen af disse formuleringer på kortsigtede versus langsigtede skader og formuleringernes evne til at komme sig / ikke komme sig efter den første fornærmelse.
Denne undersøgelse anvendes til at sammenligne forskellige lipidholdige tørre øjenprodukter for deres virkning på HCEC’s metaboliske aktivitet med og uden udtørring. Ingredienserne i de testede tørøjeprodukter er beskrevet i Materialeoversigten. Ingredienserne i opløsning #1 er carboxymethylcellulose natrium (0,5%), glycerin (1%) og polysorbat 80 (0,5%), i opløsning, #2 de er let mineralsk olie (1,0%) og mineralsk olie (4,5%), og i opløsning #3 lipid er mineralsk olie og propylenglycol er demulcent. Disse lipider er de formuleringskomponenter, der forventes at yde beskyttelse af HCEC mod udtørring.
Denne protokol er designet til at bestemme de beskyttende virkninger af kunstige tåreopløsninger mod celleaftørring. I første omgang udsættes cellerne for de tørre øjendråber for at belægge cellerne. Dernæst tørres cellerne, og den metaboliske aktivitet overvåges for at vurdere, om formuleringerne kan afbøde de skadelige virkninger af udtørringsstress. Disse trin er afgørende for at forstå den samlede indvirkning, som de tørre øjenformuleringer kan have på den samlede levedygtighed af hornhinde epitelceller.
Efter at de fleste af de tørre øjenformuleringer er fjernet fra kulturbrøndene, vil kemien i de resterende molekyler, der er i kontakt med cellerne, påvirke celleafledningen. Nogle produkter indeholder mikroemulsioner af olier, der minimerer cellefordampning20. En undersøgelse, der evaluerede friktionsanalyse efter skylning, viste opretholdelse af lav friktion for nogle tørre øjenformuleringer, som kan være en indikator for den forbedrede opholdstid for de tørre øjenformuleringer21. En af begrænsningerne ved denne analyse er, at selv om udtørringsbeskyttelse kan evalueres i forhold til andre øjendråbeformuleringer, kan varigheden af denne beskyttelse ikke bestemmes på grund af den korte tørretid, der vurderes. Længere tørretider i denne in vitro-analyse kan kræve brug af flerlagskulturer, der generelt har mere fugtindhold end en cellemonomer.
Det kan være nødvendigt at justere de specifikke inkubationstider for formuleringerne på cellerne og varigheden af tørretiden, hvis temperatur- og fugtighedsværdierne ændres. Valg af temperatur, RH og luftstrøm til simulering af miljøbelastningsforhold, der kan bidrage til tørre øjne, kan være svært, da de sæsonbestemte og lokale miljøforhold er ret variable21. Moderne miljøkamre til humane undersøgelser kan variere temperaturen mellem 5 °C og 35 °C og RH mellem 5% og 95%22. Ved hjælp af et evaporimeter og tæt monterede beskyttelsesbriller blev det fastslået, at fordampningshastigheden fra hornhinden ved RH på 40-45% var 0,037 μL/cm2/min.og ved RH på 20−25% var fordampningshastigheden 0,065 μL/cm2/min.23. Hvis in vitro-modellen ser på den beskyttende virkning af formuleringer under ekstremt lave RH-forhold som i fly15, ørkener eller tørre indendørs miljøer16, kan inkubationstider være nødvendigt at reducere for at imødekomme de forbedrede fordampningshastigheder fra cellerne. I den menneskelige tårevæske er en række lipider afledt af meibomian og andre kirtler til stede, der beskytter tårerne mod fordampning. Disse lipider har forskellige smeltepunkter24. Temperaturændringer kan påvirke tårevæskens fluiditet, så test, der udføres ved omgivelsestemperatur, kan have betydeligt forskellige fordampningshastigheder end test udført ved 37 °C. Da det gennemsnitlige okulære overfladetemperaturområde er fra 32,9 til 36 °C25, anbefales det at udføre testen i nærheden af dette temperaturområde.
Ud over det metaboliske farvestof (alamarBlue), der anvendes i denne protokol, er der andre kemiske reagenser, der kan bruges til at vurdere produktformuleringers virkninger på cellemetabolisk aktivitet. Tetrazoliumsalte (MTT, XTT, MTS, WST) er alternative kemikalier, der kan anvendes. Forskellen i tetrazoliumsalte er, at MTT er et positivt ladet molekyle, så det kan komme ind i cytoplasmaet af levende celler26. MTT bliver uopløselig efter dens reduktion med NAD(P)H27. Det skal opløses, før der aflæses absorbans på en pladelæser. De øvrige tetrazoliumsalte er negativt ladede28. De skal reduceres med sekundære molekyler uden for den levende celle, fordi de ikke kan komme ind i cellen og interagere direkte med intracellulære molekyler29. For XTT-, MTS- og WST-1-assays kan tilsætningen af et elektronkoblingsmiddel 1-methoxy phenazine methosulfat (PMS) forbedre assays30. I modsætning til de metaboliske assays, der bruger tetrazoliumsalte, kræver alamarBlue ikke yderligere opløselige eller elektronkoblingsmidler. I modsætning til XTT, MTS eller WST-1 trænger alamarBlue også ind i cellemembraner og kan reduceres direkte af cellulære enzymer27,29. Direkte sammenligning af alamarBlue med tetrazoliumsalte har vist , at alamarBlue er mere følsom over for vurdering af metabolisk aktivitet af forskellige cellelinjer , herunder HCEC3,27,31,32.
Andre biokemiske endpoints kan også overvejes til evaluering af beskyttelsen af humane hornhinde epitelceller ved udtørring. Fluorescerende farvestoffer kan anvendes til at detektere cellemembranpermeabilitet og celleesteraseaktivitet1. Apoptose kan også påvises ved farvning for apptotiske markører på celleoverfladen eller ved måling for caspase aktivitet1,33. Andre analysepunkter har bestemt virkningerne af oftalmiske produkter på HCEC-snævre kryds34. Disse analyser kunne indarbejdes i fremtidige vurderinger ved hjælp af de udtørringsprocedurer, der er beskrevet i denne artikel.
Der er mange årsager til tørre øjne. Tørre øjne kan være forårsaget af nedsat udskillelse af tårer, øget okulær overfladebetændelse eller øget dehydrering på okulær overflade. For de personer, der har fordampningsfri tørt øje brug af en tør øjendråbe, der forhindrer deres celler i at tørre under udtørring betingelser kan lindre symptomerne på tørre øjne. Et af problemerne i nogle tørre øjenformuleringer er tilstedeværelsen af konserveringsmidler, der kan skade okulær overflade. Skadeceller er ikke nyttigt at tørre øjenpatienter, da det kan forårsage flere celler til at dø som sårede celler er mere modtagelige for udtørring stress35.
En nylig gennemgang artikel af Garrigue et al.36 giver en vurdering af den nuværende viden om, hvordan lipid-baserede produkter handle for at afhjælpe fordampnings-tørre øjne. Tilføjelse lipider til lipid mangelfuld tårer kan forhindre fordampning, og dermed beskytte cellerne fra udtørring. Derudover er humectants molekyler, der tiltrækker og bevarer vand på okulær overflade37. Både glycerin i opløsning #1 og propylenglycol i opløsning #3 er humectants. Opløsning #3 viste en større beskyttende virkning af HCEC, der kan have været på grund af lipid og humectant egenskaber formuleringen ingredienser.
Denne protokol er designet til at evaluere HCEC’s metaboliske aktivitet efter udsættelse for de tørre øjenformuleringer og for udtørringsstress. Ved at bruge de metoder, der er beskrevet i denne artikel, kan nye nonirriterende og beskyttende øjendråber udvikles til mennesker, der lider af fordampningstørt øje.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Alcon for at yde økonomisk støtte til disse undersøgelser.
75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
96 well plate | costar | 3370 | |
alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |