Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay
Summary
Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.
Abstract
Als de grootste en meest veelzijdige gensuperfamilie en bemiddelaars van een gamma van cellulaire signaleringstrajecten vormen G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) een van de meest veelbelovende doelstellingen voor de farmaceutische industrie. Ergo, het ontwerp, de uitvoering, en optimalisatie van GPCR ligand screening tests is van cruciaal belang, omdat ze afstandsbediening tools voor de ontdekking van geneesmiddelen en voor het manipuleren van GPCR farmacologie en resultaten vertegenwoordigen. In het verleden typeerde G-eiwitafhankelijke testen dit onderzoeksgebied, detecteerde ligand-geïnduceerde gebeurtenissen en kwantificeerde de generatie secundaire boodschappers. Echter, sinds de komst van functionele selectiviteit, evenals een toegenomen bewustzijn van een aantal andere G-eiwit-onafhankelijke trajecten en de beperkingen in verband met G-eiwit afhankelijke testen, is er een grotere druk op het creëren van alternatieve GPCR ligand screening testen. In de richting van deze inspanning beschrijven we de toepassing van een dergelijke bron, de PRESTO-Tango platform, een luciferase reporter-based systeem dat de parallelle en gelijktijdige ondervraging van de menselijke GPCR-ome mogelijk maakt, een prestatie die eerder werd beschouwd technisch en economisch onhaalbaar. Op basis van een G-eiwit onafhankelijke β-arrestin2 recruitment test, de universaliteit van β-arrestin2-gemedieerde handel en signalering bij GPCRs maakt PRESTO-TANGO een geschikt instrument voor het bestuderen van ongeveer 300 niet-olfactorische menselijke GPCRs, waaronder ongeveer 100 weesreceptoren. PreSTO-Tango’s gevoeligheid en robuustheid maken het geschikt voor primaire high-throughput schermen met behulp van samengestelde bibliotheken, gebruikt om nieuwe GPCR-doelen voor bekende geneesmiddelen te ontdekken of om nieuwe liganden voor weesreceptoren te ontdekken.
Introduction
G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) vormen de grootste en meest diverse familie van transmembraan eiwitten, die werken als communicatie-interfaces tussen een cel en zijn omgeving1. De veelzijdigheid van GPCRs wordt benadrukt door hun vermogen om een divers scala van ligands-detecteren-van neurotransmitters tot nucleotiden, peptiden tot fotonen, en nog veel meer-evenals hun vermogen om tal van downstream signalering cascades die betrokken zijn bij cellulaire groei, migratie, differentiatie, apoptose, cel vuren, etc.2,3te reguleren. Gezien hun alomtegenwoordigheid en betrokkenheid bij een veelheid van fysiologische processen, deze receptor familie is van het grootste therapeutische belang, tentoongesteld door het feit dat meer dan een derde van de momenteel beschikbare voorgeschreven medicijnen richten GPCRs4. Echter, deze bestaande therapieën alleen gericht op een kleine subset van de superfamilie (naar schatting 10%), en de farmacologie van veel GPCRs blijft onopgehelderd. Bovendien bestaan er meer dan 100 GPCRs als weesreceptoren, omdat ze niet zijn gekoppeld aan een endogene ligand5. Zo is GPCR ligand screening van cruciaal belang in deorphanisatie en de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat het de weg naar loodontdekking en -optimalisatie, en mogelijk naar de klinische onderzoeksfase, effent.
Methoden voor GPCR ligand screening zijn traditioneel gedaald in een van de twee categorieën, G-eiwit afhankelijk of G-eiwit onafhankelijke functionele testen6. GPCR-signalering wordt geregeld door heterotrimeric G-eiwitten (Gαβγ), die worden geactiveerd door de uitwisseling van GTP voor het BBP gebonden op de Gα-subeenheid7. Signalen van de geactiveerde receptor worden door G-eiwitten via secundaire boodschappers, zoals cAMP, Calcium, DAG en IP3, omgezet om downstream signalering te bemiddelen bij downstream-effectoren8. De aard van de functionele gevolgen van G-eiwitsignalering is benut om celgebaseerde testen te creëren die receptoractivering weerspiegelen. Deze methoden, die proximale (directe) of distale (indirecte) gebeurtenissen in G-eiwitsignalering meten, worden het vaakst gebruikt voor GPCR ligandscreening en zijn voornamelijk werkzaam in deorphanisatiestudies6. Voorbeelden van tests die rechtstreeks gpcr-gemedieerde G-eiwit activering meten zijn de [35S]GTPγS bindende test, die de binding van een radiolabeled en niet-hydrolyzable GTP analoog aan de Gα subunit, en Förster / bioluminescentie resonantie energieoverdracht (FRET / BRET, respectievelijk) sondes meet om GPCR-Gα en Gα/Gγ interacties te monitoren, die in de loop der jaren9,10meer tractie hebben gekregen . Tests dat monitordistale gebeurtenissen de meest gebruikte tools zijn voor GPCR-profilering; cAMP en IP1/3-testen meten bijvoorbeeld intracellulaire accumulatie van G-eiwit afhankelijke secundaire boodschappers, terwijl [Ca2+] flux- en reportertests met specifieke responselementen die betrokken zijn bij de activering van G-eiwit (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) gebeurtenissen verder onderzoeken stroomafwaarts de signaleringscascade11. Hoewel de meeste bovengenoemde tests op een hoog doorvoerniveau kunnen worden uitgevoerd, zijn vrij gevoelig, en beschikken over bepaalde testspecifieke voordelen (bijvoorbeeld discriminatie tussen full/partagonisten, neutrale antagonisten en omgekeerde agonisten in het geval van GTPγS binding, of testfunctionaliteit op levende cellen zoals [Ca2+] en IP1/3)6,er zijn helaas geen bestaande G-eiwit afhankelijke methoden die passen bij de ondervraging van de gehele druggable GPCR-ome. Dit is grotendeels te wijten aan de inheemse koppeling van meerdere G-eiwit subfamilies aan GPCRs, wat resulteert in signalering bij verschillende cascades en de onbekende G-eiwit koppeling bij wees-GPCRs. Om dit probleem te verzachten, zijn tests ontwikkeld om promiscue G-eiwitkoppeling te dwingen door middel van een gemeenschappelijke signaleringsuitlezing, zoals cAMP, en Ca2+, zij het dat de meeste van hen een lage doorvoer hebben12.
Een belangrijk aspect van de GPCR-levenscyclus is de beëindiging van G-eiwitafhankelijke signalering, die voor een groot deel plaatsvindt door de aanwerving van β-arrestinen die dissociatie van het G-eiwit induceert, en uiteindelijk de receptor desensibiliseren, die is gericht op clathrin-coated internalisatie13. De meest alomtegenwoordig uitgedrukte isovormen van β-arrestinzijn de niet-visuele β-arrestin1 en β-arrestin2, ook aangeduid als arrestin-2 en arrestin-3, respectievelijk14. Voer G-eiwit onafhankelijke cel-gebaseerde tests, die een nieuwe dimensie toe te voegen aan GPCR ligand screening; receptor handel, label-vrije hele cel, en β-arrestin werving testen zijn allemaal opmerkelijke voorbeelden. GPCR-smokkeltests maken gebruik van fluorophore-gelabelde liganden of co-geïnternaliseerde antilichamen gericht op de receptor15, terwijl labelvrije hele celtesten biosensoren gebruiken die cellulaire veranderingen vertalen die door ligandbinding worden veroorzaakt in kwantificeerbare uitgangen, zoals elektrische of optische signalen16. Met name, typische GPCR-β-arrestin interacties mode de β-arrestin recruitment test als een aantrekkelijk instrument in het repertoire van functionele testen17. Het Tango-systeem, voor het eerst ontwikkeld door Barnea et al. slechts tien jaar geleden, omvat de introductie van drie exogene genetische elementen: een eiwitfusie bestaande uit β-arrestin2 met een tabak etch virus protease (TEVp), een tetracycline transactivator (tTA) die via een tabak aan een GPCR is gebonden etsvirus protease decolleté site (TEVcs) en wordt voorafgegaan door een sequentie uit de C-terminus van de V2 vasopressine receptor (V2 staart) om arrestaties bij werving te bevorderen, en een reporter luciferase gen waarvan de transcriptie wordt geactiveerd door de tTA transcriptiefactor translocatie naar de kern, die na β-arrestin2 aanwerving(figuur 1) 18 wordt bevrijd van de membraanverankering ( figuur 1 )18. Kwantitatieve metingen van GPCR-activering en β-arrestin2-rekrutering kunnen vervolgens worden bepaald door te lezen voor luminescentie. Een opmerkelijk onderscheid is dat, terwijl receptorhandel en labelvrije hele celmethoden relatief lage doorvoer zijn, de Tango verschillende voordelen heeft, waaronder selectieve uitlezing die specifiek is voor de doelreceptor en gevoeligheid als gevolg van signaalintegratie, waardoor het een geschikte kandidaat is voor ligandscreening op grotere schaal18.
Met het oog op deze strategische kenmerken ontwikkelden Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), een high-throughput open-source platform dat de Tango-aanpak gebruikt om de druggable GPCR-ome parallel en gelijktijdig te profileren19. PreSTO-Tango maakt gebruik van de “promiscue” rekrutering van β-arrestin2 voor bijna alle GPCRs, en is de eerste-van-zijn-soort in termen van op cellen gebaseerde functionele testen, waardoor snelle “eerste ronde” screening van kleine molecuulverbindingen bij bijna alle niet-reukgvr’s, inclusief wezen, onafhankelijk van de G-eiwit subfamiliekoppeling mogelijk is.
Protocol
Representative Results
Discussion
De conformatiedynamische GPCRs zijn krachtpatsers van signaaltransductie. De fysiochemische eigenschappen van de bindende zakken van deze heptahelical receptoren, evenals hun fysiologische relevantie onderstrepen de noodzaak van GPCR ligand screening tools. Zoals hierboven gepresenteerd, de PRESTO-Tango test is snel, gevoelig en gebruiksvriendelijk, lenen zich aan de ontwikkeling van geneesmiddelen. Niet alleen meet deze test agonist-geïnduceerde activering, maar het kan ook worden gebruikt om de activiteit van antagoni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).
Materials
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).
- Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
- Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
- Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
- Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -. M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
- Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
- Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
- Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
- Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
- Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. Illuminating the life of GPCRs. Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).
- Fang, Y. Label-Free Receptor Assays. Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).
- Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
- Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).
- Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).
- Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).
- Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
- Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
- Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
- Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of “Frequent Hitters” in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).
