PRESTO-टैंगो परख का उपयोग कर एक GPCR-वाइड पैमाने पर लिगांड स्क्रीनिंग के लिए 2 भर्ती के समानांतर पूछताछ
Summary
यह देखते हुए कि जीपीसीआरएस आकर्षक नशीले लक्ष्य हैं, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग इस प्रकार सीसा यौगिकों की पहचान और अअनाथअध्ययन के लिए अपरिहार्य है । इन प्रयासों की दिशा में, हम PRESTO-टैंगो का वर्णन करते हैं, जो एक ओपन-सोर्स संसाधन मंच है जो TEV आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग करके लगभग 300 जीपीसीआर में क्षणिक-arrestin2 भर्ती की एक साथ प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किया जाता है।
Abstract
सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों के सरगम के सबसे बड़े और सबसे बहुमुखी जीन सुपरफैमिली और मध्यस्थों के रूप में, जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) दवा उद्योग के लिए सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। एर्गो, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग परखों का डिजाइन, कार्यान्वयन और अनुकूलन महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे दवा की खोज के लिए रिमोट-कंट्रोल टूल का प्रतिनिधित्व करते हैं और जीपीसीआर फार्माकोलॉजी और परिणामों में हेरफेर के लिए। अतीत में, जी-प्रोटीन पर निर्भर परख अनुसंधान के इस क्षेत्र को टाइप करता है, लिगामेंट-प्रेरित घटनाओं का पता लगाता है और माध्यमिक दूतों की पीढ़ी की मात्रा निर्धारित करता है। हालांकि, कार्यात्मक चयनात्मकता के आगमन के बाद से, साथ ही कई अन्य जी प्रोटीन-स्वतंत्र रास्तों और जी-प्रोटीन पर निर्भर परखों से जुड़ी सीमाओं के बारे में बढ़ी हुई जागरूकता, वैकल्पिक के निर्माण की दिशा में अधिक धक्का है जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग परख ती है। इस प्रयास की दिशा में, हम ऐसे ही एक संसाधन के आवेदन का वर्णन करते हैं, प्रेस्टो-टैंगो प्लेटफॉर्म, एक ल्यूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर-आधारित प्रणाली जो मानव जीपीसीआर-ओम के समानांतर और एक साथ पूछताछ को सक्षम बनाती है, एक उपलब्धि जो पहले माना जाता था तकनीकी और आर्थिक रूप से अव्यवहार्य । जी-प्रोटीन स्वतंत्र के आधार पर 2 भर्ती परख, जीपीसीआरएस में 2-मध्यस्थता तस्करी और सिग्नलिंग में 2-गिरफ्तारी की सार्वभौमिकता प्रेस्टो-टैंगो को लगभग 300 गैर-घ्राण मानव GPCRs का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण बनाती है, जिसमें लगभग 100 शामिल हैं अनाथ रिसेप्टर्स। PRESTO-टैंगो की संवेदनशीलता और मजबूती यह यौगिक पुस्तकालयों का उपयोग कर प्राथमिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं, ज्ञात दवाओं के लिए नए GPCR लक्ष्यों को उजागर करने के लिए या अनाथ रिसेप्टर्स के लिए नए ligands की खोज करने के लिए कार्यरत हैं ।
Introduction
जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के सबसे बड़े और सबसे विविध परिवार का गठन करते हैं, जो कोशिका और उसके पर्यावरण1के बीच संचार इंटरफेस के रूप में काम करते हैं। जीपीसीआरएस की बहुमुखी प्रतिभा को लिगांड की एक विविध सरणी का पता लगाने की उनकी क्षमता से प्रकाश डाला जाता है- न्यूरोट्रांसमीटर से न्यूक्लियोटाइड्स तक, पेप्टाइड्स से फोटॉन, और कई औरअधिक – साथ ही सेलुलर विकास, प्रवास, भेदभाव, एपोप्टोसिस, सेल फायरिंग आदि में शामिल कई डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को विनियमित करने की उनकीक्षमता। उनकी सर्वव्यापकता और शारीरिक प्रक्रियाओं की एक भीड़ में शामिल होने को ध्यान में रखते हुए, इस रिसेप्टर परिवार अत्यंत चिकित्सीय महत्व का है, इस तथ्य से प्रदर्शित किया गया है कि वर्तमान में उपलब्ध दवाओं के एक तिहाई से अधिक GPCRs4लक्ष्य । हालांकि, ये मौजूदा चिकित्सा विज्ञान केवल सुपरफैमिली (अनुमानित 10%) के एक छोटे सबसेट को लक्षित करते हैं, और कई जीपीसीआरएस की फार्माकोलॉजी असंबंधित बनी हुई है। इसके अलावा, 100 से अधिक जीपीसीआरएस अनाथ रिसेप्टर्स के रूप में मौजूद हैं, क्योंकि उनका मिलान एक एंडोजेनस लिगांड5से नहीं किया गया है। इस प्रकार, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग अनाथीकरण और दवा विकास में महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह लीड खोज और अनुकूलन की दिशा में मार्ग प्रशस्त करता है, और संभवतः नैदानिक परीक्षण चरण के लिए।
जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग के लिए तरीके पारंपरिक रूप से दो श्रेणियों में से एक में गिर गए हैं, जी-प्रोटीन निर्भर या जी-प्रोटीन स्वतंत्र कार्यात्मक परख6। जीपीसीआर सिग्नलिंग को विषमतात्मक जी-प्रोटीन (Gαο) द्वारा विनियमित किया जाता है, जो जीएलपी के लिए जीटीपी के आदान-प्रदान से सक्रिय होते हैं जो Gα उपइकान7पर बाध्य होते हैं। सक्रिय रिसेप्टर से संकेतों को सीएमपी, कैल्शियम, डेग और आईपी 3 जैसे माध्यमिक दूतों के माध्यम से जी-प्रोटीन द्वारा स्थानांतरित किया जाता है, जो डाउनस्ट्रीमप्रभावकों 8पर डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग में मध्यस्थता करने के लिए होता है। जी प्रोटीन सिग्नलिंग के कार्यात्मक परिणामों की प्रकृति का दोहन सेल आधारित परख बनाने के लिए किया गया है जो रिसेप्टर सक्रियण को प्रतिबिंबित करते हैं । ये तरीके, जो जी-प्रोटीन सिग्नलिंग में समीपस्थ (प्रत्यक्ष) या डिस्टल (अप्रत्यक्ष) घटनाओं को मापते हैं, का उपयोग अक्सर जीपीसीआर लिगलैंड स्क्रीनिंग के लिए किया जाता है और मुख्य रूप से डीलमोथेशन स्टडीज6में नियोजित किया गया है। परख ों के उदाहरण जो सीधे जीपीसीआर-मध्यस्थता जी-प्रोटीन सक्रियण को मापते हैं, उनमें [35S] GTPοS बाध्यकारी परख शामिल है, जो Gα उपइकाई के लिए एक रेडियोलेबल और गैर हाइड्रोलाइजेबल जीटीपी एनालॉग के बाध्यकारी उपाय, और Förster/bioluminescence अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET/BRET, क्रमशः) जांच GPCR-Gα और Gα/Gο बातचीत है, जोपिछले कुछवर्षों में अधिक कर्षण प्राप्त कर रहा है की निगरानी के लिए 9,10। Asकहते हैं कि जिला घटनाओं की निगरानी जीपीसीआर प्रोफाइलिंग के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं; उदाहरण के लिए, सीएएमपी और IP1/3 परख जी-प्रोटीन निर्भर माध्यमिक दूतों के इंट्रासेलर संचय को मापते हैं, जबकि [सीए2 + ]प्रवाह और रिपोर्टर परखों में जी-प्रोटीन सक्रियण (सीआरई, NFAT-RE, एसआरई, एसआरएफ-आरई) में फंसाए गए विशिष्ट प्रतिक्रिया तत्वशामिल हैं, जो सिग्नलिंग कैस्केड11को और डाउनस्ट्रीम करते हैं । जबकि उपरोक्त अधिकांश परखों को उच्च-थ्रूपुट स्तर पर किया जा सकता है, काफी संवेदनशील हैं, और कुछ परख-विशिष्ट लाभों का दावा करते हैं (उदाहरण के लिए, GTPοS बाध्यकारी, या लाइव कोशिकाओं पर परख कार्यक्षमता जैसे [सीए2 +] और IP1/3)6के मामले में पूर्ण/आंशिक agonists, तटस्थ विरोधी और विलोम agonists के बीच भेदभाव, दुर्भाग्य से कोई मौजूदा जी-प्रोटीन निर्भर तरीके हैं जो पूरे दवाजी जीपीसीआर-ओम की पूछताछ के लिए उपयुक्त हैं। यह काफी हद तक जीपीसीआरएस के लिए कई जी प्रोटीन उपपरिवारों के देशी युग्मन के कारण है, जिसके परिणामस्वरूप कई झरने और अनाथ GPCRs पर अज्ञात जी प्रोटीन युग्मन पर संकेत है । इस मुद्दे को कम करने के लिए, परखों को एक आम सिग्नलिंग रीड-आउट के माध्यम से संकीर्ण जी-प्रोटीन युग्मन को मजबूर करने के लिए विकसित किया गया है, जैसे सीएएमपी, और सीए2 +,हालांकि उनमें से अधिकांश कम थ्रूपुट12हैं।
जीपीसीआर जीवनचक्र का एक महत्वपूर्ण पहलू जी-प्रोटीन-निर्भर सिग्नलिंग की समाप्ति है, जो बड़े हिस्से में जी-प्रोटीन के विसोशन को प्रेरित करने वाले गिरफ्तारकरने के माध्यम से होता है, और अंततः रिसेप्टर को हतोत्साहित करता है, जिसे क्लैथरिन-लेपित आंतरिककरण13के लिए लक्षित किया जाता है। 1 में गिरफ्तार किए गए अदृश्य और गिरफ्तार 2 में क्रमश: गिरफ्तारी-2 और गिरफ्तार-3 के रूप में भी दर्शाया गयाहै। जी-प्रोटीन स्वतंत्र सेल आधारित परख दर्ज करें, जो जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग में एक नया आयाम जोड़ते हैं; रिसेप्टर तस्करी, लेबल मुक्त पूरे सेल, और भर्ती परख में गिरफ्तार सभी उल्लेखनीय उदाहरण हैं । जीपीसीआर ट्रैफिकिंग परखों में फ्लोरोफोर-लेबल वाले लिगांडया को रिसेप्टर15को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जबकि लेबल-फ्री साबुत सेल परखबायोसेंसर का उपयोग करते हैं जो लिगांड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित सेलुलर परिवर्तनों को मात्रात्मक आउटपुट में अनुवाद करते हैं, जैसे इलेक्ट्रिकल या ऑप्टिकल सिग्नल16। विशेष रूप से, सर्वोत्कृष्ट GPCR–बातचीत में गिरफ्तार कार्यात्मक परख17के प्रदर्शनों की सूची में एक आकर्षक उपकरण के रूप में भर्ती परख में गिरफ्तार फैशन । टैंगो प्रणाली, पहले बार्नेया एट अल द्वारा विकसित केवल एक दशक पहले, तीन एक्सोजेनस आनुवंशिक तत्वों की शुरूआत शामिल है: एक प्रोटीन फ्यूजन जिसमें तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस प्रोटीज़ (TEVp), एक टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेट (टीटीए) के साथ 2 को शामिल किया गया है जो तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस प्रो के माध्यम से जीपीसीआर के लिए सीमित है tease दरार साइट (TEVcs) और सी से पहले है V2 vasopressin रिसेप्टर (V2 पूंछ) के टर्मिनस से एक अनुक्रम के लिए भर्ती में गिरफ्तारी को बढ़ावा देने के लिए, और एक रिपोर्टर लूसिफेरेज़ जीन जिसका प्रतिलेखन द्वारा शुरू हो रहा है टीटीए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर न्यूक्लियस में ट्रांसलोकेशन, जो 2 भर्ती में 2 -arrestining(चित्रा 1)18के बाद झिल्ली प्रस्तोता से मुक्त है । जीपीसीआर एक्टिवेशन और 2 भर्ती में गिरफ्तार करने की मात्रात्मक रीडिंग बाद में ल्यूमिनेसेंस के लिए पढ़कर निर्धारित की जा सकती है। एक उल्लेखनीय अंतर यह है कि जबकि रिसेप्टर तस्करी और लेबल मुक्त पूरे सेल विधियां अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट हैं, टैंगो के कई फायदे हैं, जिनमें चयनात्मक रीड-आउट शामिल हैं जो सिग्नल एकीकरण के कारण लक्ष्य रिसेप्टर और संवेदनशीलता के लिए विशिष्ट है, जो इसे बड़े पैमाने पर लिगामेंट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त उम्मीदवार बनाते हैं18।
इन रणनीतिक विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, क्रोज़े एट अल ने प्रेस्टो-टैंगो (ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट-टैंगो के माध्यम से समानांतर रिसेप्टर-ओम एक्सप्रेशन और स्क्रीनिंग) विकसित किया, जो एक उच्च-थ्रूपुट ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म है जो समानांतर और एक साथतरीकेसे ड्रगेबल जीपीसीआर-ओम को प्रोफाइल करने के लिए टैंगो दृष्टिकोण का उपयोग करता है। लगभग सभी GPCRs के लिए 2 की “संकीर्ण” भर्ती का शोषण, PRESTO-टैंगो सेल आधारित कार्यात्मक परख के मामले में अपनी तरह का पहला है, लगभग सभी गैर घ्राण GPCRs पर छोटे अणु यौगिकों की तेजी से “पहले दौर” स्क्रीनिंग सक्षम करने, अनाथ सहित, जी प्रोटीन उपपरिवार युग्मन से स्वतंत्र ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सहमति से गतिशील जीपीसीआरएस सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन के पावरहाउस हैं। इन हेप्टाहेलिक रिसेप्टर्स की बाध्यकारी जेब के शारीरिक गुण, साथ ही उनकी शारीरिक प्रासंगिकता जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग टूल की आ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कनाडा के इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर ग्रांट #MOP142219) ने सपोर्ट किया ।
Materials
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
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