Доставка модифицированной мРНК в модели мыши инфаркта миокарда
Summary
Этот протокол представляет собой простой и последовательный способ превок ликуляции гена, представляющий интерес с помощью модРНК после инфаркта миокарда у мышей.
Abstract
Инфаркт миокарда (МИ) является ведущей причиной заболеваемости и смертности в западном мире. В последнее десятилетие генная терапия стала перспективным вариантом лечения сердечных заболеваний, благодаря его эффективности и исключительным терапевтическим эффектам. В усилии отремонтировать поврежденные ткани post-MI, различные изучения использовали дна-основанную или вирусную терапию гена но смотрели на значительные барьеры из-за плохого и неконтролируемого выражения поставленных генов, отека, аритмии, и сердечной гипертрофии. Синтетическая модифицированная мРНК (модРНК) представляет собой новый подход к генной терапии, который предлагает высокую, преходящую, безопасную, неиммунизную и контролируемую доставку мРНК в сердечную ткань без риска геномной интеграции. Благодаря этим замечательным характеристикам в сочетании с колоколообразной фармакокинетикой в сердце, модРНК стала привлекательным подходом для лечения сердечных заболеваний. Однако для повышения его эффективности in vivo необходимо следовать последовательному и надежному методу доставки. Таким образом, для максимизации эффективности доставки модРНК и согласованности урожайности в модРНК-приложениях in vivo представлен оптимизированный метод подготовки и доставки модРНК-интракардиальной инъекции в модель мыши MI. Этот протокол сделает доставку модРНК более доступной для фундаментальных и трансляционных исследований.
Introduction
Генная терапия является мощным инструментом, включающим доставку нуклеиновых кислот для лечения, лечения или профилактики заболеваний человека. Несмотря на прогресс в области диагностических и терапевтических подходов к сердечно-сосудистым заболеваниям, наблюдается ограниченный успех в доставке генов при инфаркте миокарда (МИ) и сердечной недостаточности (HF). Как простой, как процесс генной терапии кажется, это заметно сложный подход, учитывая многие факторы, которые должны быть оптимизированы перед использованием конкретного транспортного средства доставки. Правильный вектор доставки должен быть не иммуногенным, эффективным и стабильным внутри человеческого организма. Усилия в этой области породили два типа систем доставки: вирусные или невирусные. Широко используемые вирусные системы, включая передачу генов аденовирусом, ретровирусом, лентивирусом или адено-ассоциированным вирусом, показали исключительную способность к трансдукции. Однако их применение в клиниках ограничено из-за сильного иммунного ответа, индуцированного1,риска опухолевого мозга2,или наличия нейтрализующих антител3,все из которых остаются основным препятствием для широкого и эффективного применения вирусных векторов в генной терапии человека. С другой стороны, несмотря на их впечатляющую модель выражения, доставка обнаженной плазмидной ДНК показывает низкую эффективность трансфекта, в то время как передача мРНК представляет высокую иммуногенность и восприимчивость к деградации RNase4.
С обширными исследованиями в области мРНК, модРНК стала привлекательным инструментом для доставки генов в сердце и различные другие органы из-за его многочисленных преимуществ по сравнению с традиционными векторами5. Полная замена уридина естественным псевдоуридином приводит к более надежному и преходящее выражение белка, с минимальной индукцией врожденного иммунного ответа и риском геномной интеграции6. Недавно созданные протоколы используют оптимизированное количество аналога противооборотной крышки (ARCA), что еще больше усиливает перевод белка, повышая стабильность и трансабельность синтетической мРНК7.
Предыдущие отчеты показали экспрессию различных репортеров или функциональных генов, поставляемых модРНК в миокарде грызунов после И.В. С модРНК-приложений, значительные области миокарда, в том числе как кардиомиоцитов и noncardiomyocytes, были успешно трансфицированы пост-сердечной травмы8, чтобы вызвать ангиогенез9,10, выживаемость сердечной клетки11, и пролиферации кардиомиоцитов12. Одно администрирование модРНК, закодированного для мутировавших человеческих фоллистатиноподобных 1, вызывает распространение мыши взрослых КМ и значительно увеличивает сердечную функцию, уменьшает размер рубца и увеличивает плотность капилляров 4 недели после MI12. Более недавнее исследование сообщило улучшение сердечной функции после MI с применением модРНК VEGFA в модели свиней10.
Таким образом, с ростом популярности модРНК в области сердца, необходимо разработать и оптимизировать протокол для доставки модРНК в сердце пост-MI. Здесь есть протокол, описывающий подготовку и доставку очищенной и оптимизированной модРНК в биосовместимой цитрат-солевой формулировке, которая обеспечивает надежное, стабильное выражение белка без стимулирования иммунного ответа. Метод, показанный в этом протоколе и видео демонстрирует стандартную хирургическую процедуру мыши MI путем постоянной перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD), а затем три участка интракардовых инъекций модРНК. Целью данной работы является четкое определение высокоточного и воспроизводимого метода доставки модРНК в муринский миокард, чтобы сделать применение модРНК широко доступным для сердечной генной терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генная терапия показала огромный потенциал для значительного продвижения лечения сердечных заболеваний. Тем не менее, традиционные инструменты, используемые в первоначальных клинических испытаниях для лечения HF показали ограниченный успех и связаны с тяжелыми побочными эффектами. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают Анну Ану Курян за ее помощь с этой рукописью. Эта работа была профинансирована за счет гранта запуска кардиологии, присужденного лаборатории Занги, а также грантом NIH R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
