在心肌梗死小鼠模型中传递修正的mRNA
Summary
该协议提供了一种简单和连贯的方法，在小鼠心肌梗死后，使用modRNA暂时调节感兴趣的基因。
Abstract
心肌梗死（MI）是西方世界发病率和死亡率的主要原因。在过去十年中，基因治疗因其效率和卓越的治疗效果而成为心脏病的一种有前途的治疗选择。为了修复MI后受损的组织，各种研究采用了基于DNA或病毒基因疗法，但由于传递基因表达不力且不受控制，因此面临相当大的障碍。水肿、心律失常和心脏肥大。合成改性mRNA（modRNA）是一种新型的基因治疗方法，为心脏组织提供高、瞬态、安全、非免疫和受控的mRNA传递，没有任何基因组整合的风险。由于这些显著的特点，结合其钟形药代动力学在心脏，modRNA已成为一个有吸引力的方法治疗心脏病。然而，为了提高其在体内的有效性，需要遵循一致和可靠的交付方法。因此，为了最大限度地提高modRNA在体内应用中的modRNA输送效率和屈服一致性，提出了小鼠MI模型中一种优化的modRNA心脏内注射制备和传递方法。该协议将使modRNA交付更容易获得基础和转化研究。
Introduction
基因治疗是一种强大的工具，涉及核酸的传递，用于治疗、治愈或预防人类疾病。尽管在心脏病的诊断和治疗方法方面取得了进展，但在心肌梗死（MI）和心力衰竭（HF）的基因传递方面，成功程度有限。与基因治疗过程一样简单，考虑到在使用特定交付工具之前需要优化的许多因素，这种方法显然很复杂。正确的传递载体应该是非免疫性、高效性和稳定的人体内部。这一领域的努力产生了两种类型的输送系统：病毒或非病毒。广泛使用的病毒系统，包括腺病毒、逆转录病毒、扁病毒或腺相关病毒的基因转移，都显示出了特殊的转导能力。然而，由于诱导的强免疫反应1、肿瘤发生的风险2或中和抗体3的存在，这些抗体在诊所的使用是有限的，所有这些都仍然是病毒载体在人类基因治疗中广泛和有效应用的主要障碍。另一方面，尽管其令人印象深刻的表达模式，裸质质质DNA的传递显示低转染效率，而mRNA转移表现出高免疫原性和易退化的RNase4。
随着mRNA领域的广泛研究，modRNA因其比传统载体5具有许多优势，已成为将基因输送到心脏和各种其他器官的诱人工具。用自然产生的伪尿丁完全取代尿氨酸，导致更健壮和瞬态的蛋白质表达，与自然免疫反应的最小诱导和基因组整合的风险6。最近建立的协议使用优化量的抗反向帽模拟（ARCA），通过提高合成mRNA7的稳定性和可转换性，进一步增强蛋白质的转化。
以前的报告已经表明，在MI之后，modRNA在啮齿动物心肌中传递的各种报告器或功能基因的表达。在ModRNA应用方面，心肌病的显著区域，包括心肌细胞和非心肌细胞，已成功转染后心肌损伤8，诱导血管生成9,9，10，心脏细胞生存11，和心肌细胞增殖12。单次为突变的人类卵泡素1编码的modRNA，可诱导小鼠成年CM的增殖，并显著增加心脏功能，减少疤痕大小，并增加MI12后4周的毛细管密度。最近的一项研究报告说，在MI之后，在猪模型10中应用VEGFA modRNA，心脏功能有所改善。
因此，随着modRNA在心脏领域的日益普及，开发和优化一种将modRNA输送到MI后心脏的协议至关重要。 Herein是一种描述生物相容性酸碱制剂中纯化和优化的modRNA制备和输送的协议，提供健壮、稳定的蛋白质表达，而不会刺激任何免疫反应。本协议和视频中所示的方法演示了小鼠MI的标准外科程序，通过左前部下部动脉（LAD）的永久连接，然后是三个部位的心肌注射modRNA。本文旨在明确定义一种高度准确和可重复的modRNA输送方法，以达到小鼠心肌，使modRNA的应用在心脏基因治疗中广泛普及。
Protocol
Representative Results
Discussion
基因治疗在显著推进心脏病治疗方面显示出巨大的潜力。然而，在治疗HF的最初临床试验中使用的传统工具已证明成功有限，并与严重的副作用有关。修饰RNA呈现非病毒基因传递，作为心脏的基因转移工具越来越受欢迎。ModRNA不需要基因的核定位进行翻译，因此提供有效和快速的蛋白质表达。此外，由于mRNA不集成到基因组宿主中，modRNA的基因传递跳过了诱变的风险。因此，由于其比传统的基因传?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢安·阿努·库里安帮助这份手稿。这项工作由授予赞吉实验室的心脏病学启动赠款以及NIH授予R01 HL142768-01资助。
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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