Levering av modifisert mRNA i en hjerteinfarkt mus modell

Summary

Denne protokollen presenterer en enkel og sammenhengende måte å midlertidig oppreisning et gen av interesse ved hjelp av modRNA etter hjerteinfarkt hos mus.

Abstract

Hjerteinfarkt (MI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden. I det siste tiåret har genterapi blitt et lovende behandlingsalternativ for hjertesykdom, på grunn av effektiviteten og eksepsjonelle terapeutiske effekter. I et forsøk på å reparere det skadede vevet etter MI har ulike studier brukt DNA-basert eller viral genterapi, men har møtt betydelige hindringer på grunn av det dårlige og ukontrollerte uttrykket av de leverte genene, ødemet, arytmien og hjertehypertrofi. Syntetisk modifisert mRNA (modRNA) presenterer en ny genterapi tilnærming som tilbyr høy, forbigående, trygg, nonimmunogen, og kontrollert mRNA levering til hjertevevet uten risiko for genomisk integrasjon. På grunn av disse bemerkelsesverdige egenskapene kombinert med sin klokkeformede farmakokinetikk i hjertet, har modRNA blitt en attraktiv tilnærming for behandling av hjertesykdom. Men for å øke effektiviteten in vivo, må en konsekvent og pålitelig leveringsmetode følges. Derfor, for å maksimere modRNA levering effektivitet og gi konsistens i modRNA bruk for in vivo applikasjoner, en optimalisert metode for forberedelse og levering av modRNA intracardiac injeksjon i en mus MI-modell presenteres. Denne protokollen vil gjøre modRNA levering mer tilgjengelig for grunnleggende og translasjonell forskning.

Introduction

Genterapi er et kraftig verktøy som involverer levering av nukleinsyrer for behandling, kur eller forebygging av menneskelige sykdommer. Til tross for fremgangen i diagnostiske og terapeutiske tilnærminger for hjertesykdom, har det vært begrenset suksess i levering av gener i hjerteinfarkt (MI) og hjertesvikt (HF). Så enkelt som prosessen med genterapi ser ut, er det en markert kompleks tilnærming med tanke på de mange faktorene som må optimaliseres før du bruker et bestemt leveringskjøretøy. Den riktige leveringsvektoren skal være ikke-immunogen, effektiv og stabil inne i menneskekroppen. Arbeidet på dette feltet har generert to typer leveringssystemer: viral eller ikke-viral. De mye brukte virussystemene, inkludert genoverføring av adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-assosiert virus, har vist eksepsjonell transduksjonskapasitet. Imidlertid er deres bruk i klinikker begrenset på grunn av den sterke immunresponsen indusert¹, risiko for tumorigenesis², eller tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer³, som alle forblir et stort hinder for bred og effektiv anvendelse av virale vektorer i menneskelig genterapi. På den annen side, til tross for deres imponerende uttrykksmønster, viser levering av naken plasmid DNA en lav transfection effektivitet, mens mRNA overføring presenterer høy immunogenitet og mottakelighet for nedbrytning av RNase⁴.

Med den omfattende forskningen innen mRNA har modRNA blitt et attraktivt verktøy for levering av gener til hjertet og ulike andre organer på grunn av sine mange fordeler fremfor tradisjonelle vektorer⁵. Fullstendig utskifting av uridin med naturlig forekommende pseudouridin resulterer i mer robust og forbigående proteinuttrykk, med minimal induksjon av medfødt immunrespons og risiko for genomisk integrasjon⁶. Nylig etablerte protokoller bruker en optimalisert mengde anti-omvendt cap analog (ARCA) som ytterligere forbedrer proteinoversettelsen ved å øke stabiliteten og transabiliteten til den syntetiske mRNA⁷.

Tidligere rapporter har vist uttrykk for ulike reporter eller funksjonelle gener levert av modRNA i gnager myokardiet etter MI. Med modRNA-applikasjoner har betydelige områder av myokardiet, inkludert både kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter, blitt vellykket transfisert post-hjerteskade⁸ for å indusere angiogenese^9,,10,hjertecelleoverlevelse¹¹, og kardiomyocyteproliferasjon¹². En enkelt administrasjon av modRNA kodet for mutert menneskelig follistatin-lignende 1 induserer spredning av mus voksen CMs og øker hjertefunksjonen betydelig, reduserer arrstørrelse, og øker kapillærtetthet 4 uker etter MI¹². En nyere studie rapporterte forbedret hjertefunksjon etter MI med anvendelse av VEGFA modRNA i en svinemodell¹⁰.

Dermed, med økt popularitet av modRNA i hjertefeltet, er det viktig å utvikle og optimalisere en protokoll for levering av modRNA til hjertet post-MI. Her er en protokoll som beskriver utarbeidelse og levering av renset og optimalisert modRNA i en biokompatibel citrate-saltvann formulering som gir robust, stabilt proteinuttrykk uten å stimulere noen immunrespons. Metoden som vises i denne protokollen og videoen demonstrerer standard kirurgisk prosedyre av en mus MI ved permanent ligation av venstre fremre synkende arterie (LAD), etterfulgt av tre sted intracardiac injeksjoner av modRNA. Målet for dette papiret er å klart definere en svært nøyaktig og reproduserbar metode for modRNA levering til murine myokardiet for å gjøre modRNA søknad allment tilgjengelig for hjertegenterapi.

Protocol

Alle dyreprosedyrer som er skissert her, er godkjent av Icahn School of Medicine ved Mount Sinai Institutional Care and Use Committee. 1. Syntese av modRNA MERK: Detaljene i modRNA syntese finnes i Kondrat et al.13. Bestill plasmidmalene (Tabell over materialer) og generer et rent PCR-produkt som skal brukes som mRNA-mal. Forbered modRNAs ved transkripsjon in vitro med en tilpasset ribonucleoside blanding …

Representative Results

Åtte til ti uker gamle mus ble bedøvet med isofluran og intubert. Etter at dyret var under anestesi, ble venstre thoraxregion barbert og sterilisert med etanol, og hjertet ble utsatt for LAD ligation. Venstre koronararterie ble okkludert ved å knytte suturen under arterien (diagramrepresentasjon Figur 1A). Etter et vellykket infarkt (indikert ved paling av venstre ventrikulær fri vegg), ble en direkte injeksjon av 100 μg Luc eller Cre modRNA oppløst i sukrose citratbuffer levert direkt…

Discussion

Genterapi har vist et enormt potensial til å redusere behandlingen av hjertesykdom betydelig. Tradisjonelle verktøy som brukes i de første kliniske studiene for behandling av HF har imidlertid vist begrenset suksess og er forbundet med alvorlige bivirkninger. Modifisert RNA presenterer en nonviral genlevering som kontinuerlig blir populært som et genoverføringsverktøy i hjertet. ModRNA krever ingen kjernefysisk lokalisering av gener for oversettelse, og tilbyr dermed et effektivt og raskt uttrykk for proteinet. Vid…

Materials

Adenosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Bioluminescense imaging system	Perkin Elmer	124262	IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors	FST	18200-09
Cardiac tropnin I	Abcam	47003
Cytidine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System	Harvard Apparatus	75-2001
Forceps- Adson	FST	91106-12
Forceps- Dumont #7	FST	91197-00
Guanosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
In vitro transcription kit	Invitrogen	AMB13345	5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula	Harvard Apparatus
Megaclear kit	Life Technologies
Mouse ventilator	Harvard Apparatus	73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate	TriLink Biotechnologies	N-1081
NanoDrop Spectrometer	Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors	FST	12002-12
Plasmid templates	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	FST	14200-12
Stereomicroscope	Zeiss
Sutures	Ethicon	Y433H	5.00
Sutures	Ethicon	Y432H	6.00
Sutures	Ethicon	7733G	7.00
T7 DNase enzyme	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Tape station	Aligent	4200
Transcription clean up kit	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k	Amicon	UFC801096