Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

Summary

Este protocolo presenta un procedimiento detallado para preparar criomuestras biológicas para experimentos de espectroscopia de absorción de rayos X basados en sincrotrón. Describimos todos los pasos necesarios para optimizar la preparación y criopreservación de muestras con ejemplos del protocolo con células de cáncer y fitoplancton. Este método proporciona un estándar universal de criopreparación de muestras.

Abstract

El estudio de elementos con espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) es de particular interés cuando se estudia el papel de los metales en los sistemas biológicos. La preparación de muestras es un procedimiento clave y a menudo complejo, particularmente para muestras biológicas. Aunque las técnicas de especiación de rayos X son ampliamente utilizadas, aún no se ha difundido ningún protocolo detallado para los usuarios de la técnica. Además, la modificación del estado químico es motivo de preocupación, y se recomiendan técnicas basadas en crioterapia para analizar las muestras biológicas en su estado hidratado casi nativo para proporcionar la máxima preservación de la integridad química de las células o tejidos. Aquí, proponemos un protocolo de preparación celular basado en muestras criopreservadas. Se demuestra en un estudio de espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución de fluorescencia detectada de selenio en células cancerosas y un estudio de hierro en fitoplancton. Este protocolo se puede utilizar con otras muestras biológicas y otras técnicas de rayos X que pueden dañarse por irradiación.

Introduction

El estudio de las biotransformaciones celulares de elementos esenciales o tóxicos requiere técnicas de especiación con alta sensibilidad y debe minimizar los pasos de preparación de muestras que a menudo son propensos a la modificación de especies químicas.

Se sabe que los elementos fisiológicos como el selenio y el hierro son particularmente difíciles de especificar debido a su química compleja, varias estabilidades de las especies de selenio o hierro, y su baja concentración en el rango de ppm (mg / kg) o incluso sub-ppm. Por lo tanto, el estudio de la especiación de estos elementos por XAS puede ser extremadamente desafiante. El sincrotrón XAS y especialmente la fluorescencia de alta resolución de energía detectada XAS (HERFD-XAS), que permite una relación señal-fondo muy baja¹, están disponibles en fuentes de sincrotrón para especiar elementos altamente diluidos en matrices biológicas complejas ^2,3. Las mediciones convencionales de fluorescencia-XAS se pueden realizar utilizando un detector de estado sólido (SSD) de energía resuelta con un ancho de banda de energía ~ 150–250 eV, en la línea de haz CRG-FAME en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF)⁴, mientras que las mediciones HERFD-XAS necesitan un espectrómetro analizador de cristal (CAS), con un ancho de banda de energía ~ 1–3 eV, en la línea de haz CRG-FAME-UHD en el ESRF² . Los fotones de fluorescencia son discriminados con respecto a su energía con procesos electrónicos u ópticos respectivamente.

La criopreparación de la muestra es esencial para preservar las estructuras y mantener la integridad química de la composición, lo que permite un análisis cercano al estado biológico nativo⁵. Además, los análisis realizados a temperaturas criogénicas tan bajas como 10 K utilizando enfriamiento criogénico de helio líquido (LN₂), permiten que el daño por radiación disminuya la velocidad y preserve la especiación elemental para XAS. Aunque algunas revisiones sobre técnicas XAS aplicadas a muestras biológicas informan de la necesidad de preparar y analizar muestras en condiciones criogénicas (por ejemplo, Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), ninguna de ellas describe claramente el protocolo detallado relacionado. En esta publicación, se describe un método para la criopreparación de células cancerosas y microorganismos de plancton para la especiación HERFD-XAS de Se⁸ y Fe⁹ a temperatura criogénica.

Las buenas prácticas para la preparación de muestras y el entorno durante las mediciones de espectroscopia XAS de última generación requieren 1) una configuración; 2) un procedimiento de análisis que limite al máximo los efectos del daño por radiación; y 3) una muestra (o referencia de compuesto modelo) lo más homogénea posible con respecto al tamaño del haz de fotones de rayos X. El primer elemento se tiene en cuenta realizando la adquisición a baja temperatura, utilizando un criostato de helio líquido. El segundo ítem se trata realizando cada adquisición en una zona fresca de la muestra moviéndola con respecto a la viga. Finalmente, considerando la tercera condición, las muestras (pellets) y las referencias (polvos) se acondicionan en pellets prensados a granel para limitar al máximo las porosidades e inhomogeneidades, y para evitar la rugosidad con respecto al tamaño del haz en la superficie de la muestra sonda de rayos X. Explicamos cómo el protocolo trata todos estos puntos.

Utilizamos la línea celular de próstata humana PC-3 (alto potencial metastásico) y la línea celular ovárica OVCAR-3 (que representa hasta el 70% de todos los casos de cáncer de ovario) para investigar las propiedades antiproliferativas hacia las células cancerosas de las nanopartículas de selenio (Se-NPs), y la diatomea Phaeodactylum tricornutum como especie modelo para investigar el secuestro de hierro en fitoplancton.

Protocol

1. Preparación de los gránulos de células cancerosas PC-3 y OVCAR-3 humanas para la especiación de selenio NOTA: El siguiente protocolo está adaptado de Weekley et al.10. Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo una capucha de cultivo celular bajo condiciones y restricciones de nivel de bioseguridad 2, utilizando técnicas asépticas. Cuente las células usando una cámara de conteo de células de Malassez. Sembrar 150.000-200.000 células por matraz pa…

Representative Results

Los principales objetivos de estas preparaciones fueron investigar la interacción entre las nanopartículas de selenio (Se-NP) y las células cancerosas, y la unión y secuestro de hierro en el fitoplancton. Los espectros HERFD-XANES del selenio en estado inicial (BSA Se-NPs) y en células incubadas en medio nutritivo (BSA Se-NPs después de 24 h de incubación) se muestran en la Figura 10. Los resultados mostraron que el selenio en los Se-NP iniciales estaba pre…

Discussion

Este protocolo se utilizó para estudiar la forma química del selenio y el hierro en muestras biológicas mediante espectroscopia de absorción de rayos X. Se centra en la criopreparación y almacenamiento de muestras biológicas y compuestos de referencia, así como en las mediciones HERFD-XAS.

Criopreparación y almacenamiento
La criopreparación de los pellets de muestra biológica a granel permite preservar la integridad química de las especies presentes en las muestr…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C