Biologiska prover Förberedelse för speciering vid kryogen temperatur med hjälp av högupplöst röntgenabsorptionsspektroskopi

Summary

Detta protokoll presenterar ett detaljerat förfarande för att förbereda biologiska kryomplar för synkrotronbaserade röntgenabsorptionsspektroskopiexperiment. Vi beskriver alla steg som krävs för att optimera provberedning och kryokonservering med exempel på protokollet med cancer- och växtplanktonceller. Denna metod ger en universell standard för prov kryoberedning.

Abstract

Studien av grundämnen med röntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) är av särskilt intresse när man studerar metallers roll i biologiska system. Provberedning är ett viktigt och ofta komplext förfarande, särskilt för biologiska prover. Även om röntgenspecieringstekniker används i stor utsträckning har inget detaljerat protokoll ännu spridits för användare av tekniken. Vidare är kemisk tillståndsmodifiering oroande, och kryobaserade tekniker rekommenderas för att analysera de biologiska proverna i deras nästan infödda hydratiserade tillstånd för att ge maximal bevarande av cellernas eller vävnadernas kemiska integritet. Här föreslår vi ett cellulärt beredningsprotokoll baserat på kryobevarade prover. Det demonstreras i en fluorescens med hög energiupplösning upptäckt röntgenabsorptionsspektroskopistudie av selen i cancerceller och en studie av järn i fytoplankton. Detta protokoll kan användas med andra biologiska prover och andra röntgentekniker som kan skadas av bestrålning.

Introduction

Studien av cellulära biotransformationer av väsentliga eller giftiga element kräver specieringstekniker med hög känslighet och bör minimera provberedningssteg som ofta är benägna att modifiera kemiska arter.

Fysiologiska element som selen och järn är kända för att vara särskilt svåra att specificera på grund av deras komplexa kemi, olika förmågor hos selen- eller järnarterna och deras låga koncentration i ppm (mg / kg) eller till och med under ppm-intervallet. Således kan studien av speciering av dessa element av XAS vara extremt utmanande. Synkrotron XAS och särskilt hög energiupplöst fluorescensdetekterat XAS (HERFD-XAS), som möjliggör ett mycket lågt signal-till-bakgrundsförhållande¹, finns tillgängliga vid synkrotronkällor för att specificera mycket utspädda element i komplexa biologiska matriser ^2,3. Konventionella fluorescens-XAS-mätningar kan utföras med hjälp av en energiupplöst solid state-detektor (SSD) med en energibandbredd ~ 150–250 eV, på CRG-FAME-strålröret vid European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, medan HERFD-XAS-mätningar behöver en kristallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibandbredd ~ 1–3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålröret vid ESRF² . Fluorescensfotoner diskrimineras med avseende på sin energi med elektroniska respektive optiska processer.

Provet kryoberedning är viktigt för att bevara strukturer och upprätthålla sammansättningskemisk integritet, vilket möjliggör analys nära det biologiska ursprungstillståndet⁵. Dessutom tillåter analyser som utförs vid kryogena temperaturer så låga som 10 K med flytande heliumkryogen kylning (LN₂) strålningsskador att sakta ner och bevara elementär speciering för XAS. Även om vissa recensioner av XAS-tekniker som tillämpas på biologiska prover rapporterar nödvändigheten av att förbereda och analysera prover under kryogena förhållanden (t.ex. Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), beskriver ingen av dem tydligt det relaterade detaljerade protokollet. I denna publikation beskrivs en metod för kryoberedning av cancerceller och planktonmikroorganismer för HERFD-XAS-speciering av Se⁸ och Fe⁹ vid kryogen temperatur.

God praxis för provberedning och miljö under toppmoderna XAS-spektroskopimätningar kräver 1) en installation; 2) ett analysförfarande som begränsar effekterna av strålskador så mycket som möjligt; och 3) ett prov (eller modellföreningsreferens) så homogent som möjligt med avseende på röntgenfotonstrålens strålstorlek. Det första objektet beaktas genom att utföra förvärvet vid låg temperatur med användning av en flytande heliumkryostat. Den andra posten behandlas genom att utföra varje förvärv på ett nytt område av provet genom att flytta det med avseende på strålen. Slutligen, med tanke på det tredje villkoret, konditioneras prover (pellets) och referenser (pulver) i pressade bulkpellets för att begränsa porositeter och inhomogeniteter så mycket som möjligt och för att undvika grovhet med avseende på strålstorleken på röntgensondprovytan. Vi förklarar hur protokollet behandlar alla dessa punkter.

Vi använde human prostata cellinje PC-3 (hög metastatisk potential) och äggstockscelllinje OVCAR-3 (som står för upp till 70% av alla äggstockscancerfall) för att undersöka de antiproliferativa egenskaperna mot cancerceller hos selennanopartiklar (Se-NP) och Phaeodactylum tricornutum diatom som modellart för att undersöka järnbindning i fytoplankton.

Protocol

1. Beredning av humana PC-3 och OVCAR-3 cancercellspellets för selenspeciering OBS: Följande protokoll är anpassat från Weekley et al.10. Alla steg måste utföras under en cellodlingshuv under biosäkerhetsnivå 2-förhållanden och begränsningar, med hjälp av aseptiska tekniker. Räkna cellerna med hjälp av en Malassez cellräkningskammare. Frö 150 000–200 000 celler per kolv för PC-3-cellinjen och 300 000 celler för OVCAR-3-cellinjen. …

Representative Results

Huvudsyftet med dessa preparat var att undersöka interaktionen mellan selennanopartiklar (Se-NP) och cancerceller, och järnbindning och sekvestrering i växtplankton. HERFD-XANES-spektra av selen i initialt tillstånd (BSA Se-NP) och i celler inkuberade i näringsmedium (BSA Se-NP efter 24 timmars inkubation) visas i figur 10. Resultaten visade att selen i de initiala Se-NP: erna var närvarande som både Se (0) och selenitliknande former, medan efter…

Discussion

Detta protokoll användes för att studera den kemiska formen av selen och järn i biologiska prover genom röntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserar på kryoberedning och lagring av biologiska prover och referensföreningar, liksom på HERFD-XAS-mätningarna.

Kryoberedning och lagring
Kryoberedningen av det biologiska bulkprovpelletset möjliggör bevarande av den kemiska integriteten hos de arter som finns i proverna. Detta är avgörande, eftersom artbildningsförän…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C