Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

Summary

Questo protocollo presenta una procedura dettagliata per preparare criocampioni biologici per esperimenti di spettroscopia di assorbimento dei raggi X basati su sincrotrone. Descriviamo tutti i passaggi necessari per ottimizzare la preparazione del campione e la crioconservazione con esempi del protocollo con cellule tumorali e fitoplancton. Questo metodo fornisce uno standard universale di crio-preparazione del campione.

Abstract

Lo studio degli elementi con spettroscopia di assorbimento dei raggi X (XAS) è di particolare interesse quando si studia il ruolo dei metalli nei sistemi biologici. La preparazione dei campioni è una procedura chiave e spesso complessa, in particolare per i campioni biologici. Sebbene le tecniche di speciazione a raggi X siano ampiamente utilizzate, nessun protocollo dettagliato è stato ancora diffuso per gli utenti della tecnica. Inoltre, la modifica dello stato chimico è preoccupante e si raccomandano tecniche basate sulla criografia per analizzare i campioni biologici nel loro stato idrato quasi nativo per fornire la massima conservazione dell’integrità chimica delle cellule o dei tessuti. Qui, proponiamo un protocollo di preparazione cellulare basato su campioni crioconservati. È dimostrato in uno studio di spettroscopia di assorbimento a raggi X rilevato ad alta risoluzione energetica con fluorescenza del selenio nelle cellule tumorali e in uno studio sul ferro nel fitoplancton. Questo protocollo può essere utilizzato con altri campioni biologici e altre tecniche a raggi X che possono essere danneggiate dall’irradiazione.

Introduction

Lo studio delle biotrasformazioni cellulari di elementi essenziali o tossici richiede tecniche di speciazione ad alta sensibilità e dovrebbe ridurre al minimo le fasi di preparazione del campione che sono spesso inclini alla modifica di specie chimiche.

Elementi fisiologici come il selenio e il ferro sono noti per essere particolarmente difficili da speciare a causa della loro chimica complessa, delle varie stabilità delle specie di selenio o ferro e della loro bassa concentrazione nell’intervallo ppm (mg / kg) o anche sub-ppm. Pertanto, lo studio della speciazione di questi elementi da parte di XAS può essere estremamente impegnativo. Il sincrotrone XAS e in particolare l’XAS di fluorescenza ad alta risoluzione energetica (HERFD-XAS), che consente un rapporto segnale-sfondo^{molto basso 1}, sono disponibili presso sorgenti di sincrotrone per speciare elementi altamente diluiti in matrici biologiche complesse ^2,3. Le misurazioni convenzionali di fluorescenza-XAS possono essere eseguite utilizzando un rivelatore a stato solido (SSD) a risoluzione di energia con una larghezza di banda di energia ~ 150-250 eV, sulla beamline CRG-FAME presso l’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, mentre le misurazioni HERFD-XAS richiedono uno spettrometro analizzatore di cristalli (CAS), con una larghezza di banda di energia ~ 1-3 eV, sulla beamline CRG-FAME-UHD presso l’ESRF² . I fotoni a fluorescenza sono discriminati rispetto alla loro energia rispettivamente con processi elettronici o ottici.

La crio-preparazione del campione è essenziale per preservare le strutture e mantenere l’integrità chimica compositiva, consentendo così un’analisi vicina allo stato biologico nativo⁵. Inoltre, le analisi eseguite a temperature criogeniche fino a 10 K utilizzando il raffreddamento criogenico ad elio liquido (LN₂), consentono ai danni da radiazioni di rallentare e preservare la speciazione elementare per XAS. Sebbene alcune revisioni sulle tecniche XAS applicate ai campioni biologici riportino la necessità di preparare e analizzare campioni in condizioni criogeniche (ad esempio, Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), nessuna di esse descrive chiaramente il relativo protocollo dettagliato. In questa pubblicazione, viene descritto un metodo per la crio-preparazione delle cellule tumorali e dei microrganismi plancton per la speciazione HERFD-XAS di Se⁸ e Fe⁹ a temperatura criogenica.

Le buone pratiche per la preparazione dei campioni e l’ambiente durante le misurazioni della spettroscopia XAS all’avanguardia richiedono 1) una configurazione; 2) una procedura di analisi che limiti il più possibile gli effetti dei danni da radiazioni; e 3) un campione (o modello di riferimento composto) il più omogeneo possibile rispetto alla dimensione del fascio di fotoni a raggi X. Il primo elemento viene preso in considerazione eseguendo l’acquisizione a bassa temperatura, utilizzando un criostato di elio liquido. Il secondo punto viene affrontato eseguendo ogni acquisizione su una nuova area del campione spostandolo rispetto alla trave. Infine, considerando la terza condizione, i campioni (pellet) e i riferimenti (polveri) sono condizionati in pellet sfusi pressati al fine di limitare il più possibile porosità e disomogeneità ed evitare rugosità rispetto alla dimensione del fascio sulla superficie del campione sondato a raggi X. Spieghiamo come il protocollo affronta tutti questi punti.

Abbiamo utilizzato la linea cellulare della prostata umana PC-3 (alto potenziale metastatico) e la linea cellulare ovarica OVCAR-3 (che rappresenta fino al 70% di tutti i casi di cancro ovarico) per studiare le proprietà antiproliferative verso le cellule tumorali delle nanoparticelle di selenio (Se-NP) e la diatomea Phaeodactylum tricornutum come specie modello per studiare il sequestro del ferro nel fitoplancton.

Protocol

1. Preparazione dei pellet di cellule tumorali umane PC-3 e OVCAR-3 per la speciazione del selenio NOTA: Il seguente protocollo è adattato da Weekley et al.10. Tutte le fasi devono essere eseguite sotto una cappa di coltura cellulare in condizioni e restrizioni di livello di biosicurezza 2, utilizzando tecniche asettiche. Contare le cellule usando una camera di conteggio delle cellule Malassez. Seminare 150.000-200.000 cellule per pallone per la linea cellula…

Representative Results

Gli obiettivi principali di questi preparati erano studiare l’interazione tra nanoparticelle di selenio (Se-NP) e cellule tumorali e il legame e il sequestro del ferro nel fitoplancton. Gli spettri HERFD-XANES del selenio allo stato iniziale (BSA Se-NPs) e nelle cellule incubate in mezzo nutritivo (BSA Se-NPs dopo 24 ore di incubazione) sono mostrati nella Figura 10. I risultati hanno mostrato che il selenio nelle Se-NP iniziali era presente sia come se(0)</s…

Discussion

Questo protocollo è stato utilizzato per studiare la forma chimica del selenio e del ferro in campioni biologici mediante spettroscopia di assorbimento dei raggi X. Si concentra sulla crio-preparazione e conservazione di campioni biologici e composti di riferimento, nonché sulle misurazioni HERFD-XAS.

Crio-preparazione e conservazione
La crio-preparazione dei pellet di campioni biologici sfusi consente di preservare l’integrità chimica delle specie presenti nei campioni….

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C