Overvåke eIF4F-montering ved å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler som vil gjøre det mulig for brukeren å evaluere legemiddelindusert perturbasjon av eIF4F-kompleks dynamikk i screeningformater.

Abstract

Dannelse av eIF4F-komplekset har vist seg å være nøkkelen nedstrøms node for konvergens av signalveier som ofte gjennomgår onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindende kompleks involvert i mRNA-ribosomet rekrutteringsfasen av oversettelsesinitiering. I mange cellulære og prekliniske kreftmodeller fører dereguleringen av eIF4F til økt oversettelse av spesifikke mRNA-undergrupper som er involvert i kreftproliferasjon og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget av den cap-bindende underenheten eIF4E, helicase eIF4A og stillasunderenheten eIF4G. Kritisk for montering av aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraksjonen mellom eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å måle eIF4F-montering som overvåker statusen til eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler. Den eIF4e:4G cellebaserte proteinproteininteraksjonsanalysen gjør det også mulig å vurdere legemiddelinduserte endringer i eIF4F-kompleks integritet nøyaktig og pålitelig. Vi ser for oss at denne metoden kan brukes til å verifisere aktiviteten til kommersielt tilgjengelige forbindelser eller for videre screening av nye forbindelser eller modaliteter som effektivt forstyrrer dannelsen av eIF4F-komplekset.

Introduction

Kontroll av genuttrykk spiller en sentral rolle i riktig utførelse av cellulære programmer som vekstproliferasjon og differensiering. En regulatorisk kontrollmekanisme kan utøves enten på nivået av gentranskripsjon eller på nivået av mRNA-oversettelse. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at translasjonskontroll ved modulering av initieringsprosessen i stedet for de senere trinnene for forlengelse og oppsigelse kan regulere syntesen av spesifikke undergrupper av proteiner som spiller et bredt spekter av biologiske funksjoner.

Økt oversettelse av mRNAer involvert i overlevelse, anti-autofagiske og anti-apoptotiske responser har blitt involvert i flere kreftformer og har også vært årsaksmessig knyttet til enten avvikende aktivering eller over uttrykk for oversettelse initieringsfaktorer¹.

eIF4F-komplekset er en hovedregulator for oversettelsesstart. Ved å binde cap-strukturen på 5′ enden av mRNAs, eIF4F kjører innledende mRNA-ribosome rekruttering og i sin tur øke mRNA oversettelse effektivitet av svakt oversatt eukaryotic mRNAs². eIF4F mediert oversettelse av kreftrelaterte mRNAer er rapportert for mange kreftmodeller som har avvikende aktivering av RAS/MAPK- eller AKT/TOR-veier, noe som tyder på at kreftceller oppregulerer eIF4F for å øke sin egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse av denne feed-forward sløyfen ved å hemme eIF4F kompleks dannelse er dermed en svært lovende terapeutisk strategi^3,4.

eIF4F-komplekset består av (i) eIF4E, cap-bindende underenhet av eIF4F som samhandler med hettestrukturen som finnes ved 5′ UTR av mRNA, (ii) eIF4A, RNA-helikase og (iii) eIF4G, stillasproteinet som samhandler med både eIF4A og eIF4E og som til slutt rekrutterer 40S ribosomal subenhet⁵. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighetsbegrensende trinnet for montering av funksjonelle eIF4F-komplekser, og det er negativt regulert av eIF4E-bindende proteiner (4EBPer, medlem 1, 2 og 3))⁶. Ved å konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E gjennom et grensesnitt som består av kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser^7,8,9 (region som spenner over aa 604-646 på human eIF4E), reduserer 4EBP utvalget av eIF4E som er aktivt involvert i oversettelse og forhindrer eIF4F-kompleks dannelse. Samspill mellom disse proteinproteininteraksjonene er hovedsakelig regulert av pattedyrmålet for rapamycin (mTOR)-mediert fosforylering av 4EBP. Ved mitogene stimuli, mTOR direkte fosforylater medlemmene av 4E-BP proteinfamilien, reduserer deres tilknytning til eIF4E og dermed fremmer eIF4E-eIF4G interaksjon og dannelse av funksjonelle eIF4F komplekser¹⁰.

Til tross for den store innsatsen i å utvikle forbindelser rettet mot eIF4F kompleks integritet, har mangelen på analyser som måler direkte forstyrrelse av eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler begrenset søket etter cellulære aktive treffforbindelser. Vi har brukt en luciferaseanalyse basert på en coelenterazin-analog (f.eks. Nanoluc-basert komplementasjonsanalyse) for å overvåke statusen til eIF4F-integriteten i sanntid gjennom eIF4E-eIF4G-interaksjonen. Luciferase komplementering protein system består av en 18 kDa protein fragment (SubA) og 11 aminosyre peptid fragment (SubB) optimalisert for minimal selv-assosiasjon og stabilitet¹¹. Når det uttrykkes som et fusjonsprodukt med eIF4E i full lengde og eIF4E-interaksjonsdomenet fra humant eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteinene bringe SubA- og SubB-fragmentet i nærheten av hverandre og vil indusere dannelsen av den aktive luciferase som i nærvær av et cellegjennomtrengelig substrat til slutt vil generere et sterkt lysende signal (Figur 1). Vi har rapportert andre steder bygging og validering av eIF4E: eIF4G^604-646 komplementeringssystem¹⁶.

Her beskriver vi hvordan eIF4E:eIF4G^604-646 komplementasjonssystem (tilgjengelig på forespørsel) kan brukes til å måle nøyaktig 4EBP1-mediert eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. I tillegg demonstrerer vi nytten ved å måle effekten av flere mTOR-hemmere som for tiden er under kliniske studier som potensielle kreftterapeutiske legemidler¹². Fordi off-target effekter ofte maskerer narkotikaspesifikk aktivitet, beskriver vi også hvordan allsidigheten til eIF4E:eIF4G^604-646 systemmåling kan utvides med ortogonale målinger av cellulær levedyktighet for å ta hensyn til disse.

Protocol

HEK293 cellelinje ble brukt til protokollen og ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium supplert med 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin / streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 °C med 5 % CO2 i et fuktig miljø. 1. Kvantitativ vurdering av eIF4F-komplekse forstyrrelser via eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonsanalyse Cellekultur og forbigående transfeksjon av eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonsanalyse Bruk nyt…

Representative Results

For å validere følsomheten til eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonssystem ble 4EBP1 mediert hemming av eIF4F kompleks montering vurdert ved hjelp av mTOR-hemmere. Ved å hemme mTORC1 kinase avhengig fosforylering av 4EBP proteinfamilien, forbedrer mTOR-hemming 4EBP1-tilknytning til eIF4E og derfor eIF4F demontering15. To klasser av mekanistisk forskjellige hemmere av mTOR kinases ble testet: rapaloger (f.eks. Rapamycin) som er allosteriske hemmere av mT…

Discussion

Metoden beskrevet i denne artikkelen bruker en luciferase-basert komplementeringsanalyse for kvantitativt å overvåke eIF4F kompleks montering gjennom direkte måling av eIF4G-eIF4E interaksjon i levende celler. Vi har gitt detaljer for bruk av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem, og vi har også vist at systemet er ekstremt nøyaktig i måling av legemiddelindusert 4EBP1-mediert dissosiasjon av eIF4E-eIF4G interaksjon¹⁶. For å lette gjennomstrømningen av denne analysen, er det eksperimentelle o…

Materials

293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Cell titer Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11058021
Orbital shaker	Eppendorf	not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S