Summary
En metode til ikke-målrettet analyse af hvede korn metabolitter og lipider præsenteres. Protokollen indeholder en acetonitril metabolit ekstraktionsmetode og omvendt fase flydende kromatografi-masse spektrometri metode, med erhvervelse i positive og negative elektrospray ionisering tilstande.
Abstract
En forståelse af samspillet mellem gener, miljø og forvaltning i landbrugspraksis kunne give mulighed for en mere nøjagtig forudsigelse og forvaltning af produktudbytte og -kvalitet. Metabolomics data giver en udlæsning af disse interaktioner på et givet tidspunkt og er informativ af en organismes biokemiske status. Endvidere kan individuelle metabolitter eller paneler af metabolitter anvendes som præcise biomarkører for udbytte og kvalitetsforudsigelse og -styring. Planten metabolom forventes at indeholde tusindvis af små molekyler med varierede fysisk-kemiske egenskaber, der giver mulighed for en biokemisk indsigt i fysiologiske træk og biomarkør opdagelse. For at udnytte dette, et centralt mål for metabolomics forskere er at fange så meget af den fysisk-kemiske mangfoldighed som muligt inden for en enkelt analyse. Her præsenterer vi en flydende kromatografi-masse spektrometri-baserede umålrettede metabolomics metode til analyse af markdyrket hvedekorn. Metoden bruger den flydende kromatograf kvomernære opløsningsmiddel manager til at indføre en tredje mobil fase og kombinerer en traditionel omvendt fase gradient med en lipid-modtagelig gradient. Kornforberedelse, metabolitekstraktion, instrumental analyse og databehandlingsarbejdsgange er beskrevet i detaljer. God massenøjagtighed og signalreproducerbarhed blev observeret, og metoden gav ca. 500 biologisk relevante funktioner pr. ioniseringstilstand. Endvidere blev der fastlagt betydeligt forskellige metabolit- og lipidfunktionssignaler mellem hvedesorter.
Introduction
En forståelse af samspillet mellem gener, miljø og forvaltningspraksis i landbruget kunne give mulighed for en mere nøjagtig forudsigelse og forvaltning af produktudbytte og -kvalitet. Plantemetabolitter påvirkes af faktorer som genom, miljø (klima, nedbør osv.) og i et landbrugsmiljø, hvordan afgrøder forvaltes (dvs. anvendelse af gødning, fungitid osv.). I modsætning til genomet påvirkes metabolomet af alle disse faktorer, og derfor giver metabolomiske data et biokemisk fingeraftryk af disse interaktioner på et bestemt tidspunkt. Der er normalt et af to mål for en metabolom-baseret undersøgelse: for det første at opnå en dybere forståelse af organismens biokemi og hjælpe med at forklare mekanismen for reaktion på forstyrrelser (abiotisk eller biotisk stress) i forhold til fysiologi; og for det andet at knytte biomarkører til den undersøgte forstyrrelser. I begge tilfælde er resultatet af at have denne viden en mere præcis ledelsesstrategi for at nå målet om forbedret udbyttestørrelse og kvalitet.
Planten metabolom forventes at indeholde tusindvis1 af små molekyler med varierede fysisk-kemiske egenskaber. I øjeblikket kan ingen metabolomiske platforme (overvejende massespektrometri og nuklear magnetisk resonansspektroskopi) fange hele metabolomet i en enkelt analyse. Udvikling af sådanne teknikker (prøve forberedelse, metabolit ekstraktion og analyse), som giver så stor en dækning af metabolom som muligt inden for en enkelt analytisk køre, er et centralt mål for metabolomics forskere. Tidligere ikke-målrettede metabolomanalyser af hvedekorn har kombineret data fra flere kromatografiske separationer og erhvervelsepolariteter og/eller instrumentering for større metabolomdækning. Dette har imidlertid krævet, at prøver blev fremstillet og erhvervet separat for hver modalitet. F.eks. udarbejdede Beleggia et al.2 en afledte prøve til GC-MS-analysen af polaranalysatorer ud over GC-MS-analysen af de ikke-polære analysatorer. Das et al.3 anvendte både GC- og LC-MS-metoder til at forbedre dækningen i deres analyser. Denne fremgangsmåde vil dog generelt kræve særskilte prøvepræparater som beskrevet ovenfor samt to uafhængige analytiske platforme. Tidligere analyser af hvedekorn ved hjælp af GC-MS3,5 2,,3,,4 og LC-MS 3 , 5 platforme har givet 50 til 412 (55 identificerede) funktioner til GC-MS, 409 for kombineret GC-MS og LC-MS og flere tusinde for en LC-MS lipidomics analyse5. Ved at kombinere mindst to tilstande i en enkelt analyse, udvidet metabolom dækning kan opretholdes, øge den rigdom af biologisk etolkning og samtidig tilbyde besparelser i både tid og omkostninger.
For at muliggøre en effektiv adskillelse af en bred vifte af lipidarter ved omvendt fase kromatografi, moderne lipidomics metoder almindeligt bruger en høj andel af isopropanol i eluering opløsningsmiddel6, giver forbedring til lipid klasser, der ellers ville være uløste ved kromatografi. For en effektiv lipidseparation er startmobilfasen også meget højere i organisk sammensætning7 end de typiske omvendte fasekromatografiske metoder, der tager hensyn til andre klasser af molekyler. Den høje organiske sammensætning i starten af gradienten gør disse metoder mindre egnede til mange andre klasser af molekyler. Mest bemærkelsesværdigt, omvendt fase flydende kromatografi beskæftiger en binær opløsningsmiddel gradient, begyndende med en for det meste vandig sammensætning og stigende i organisk indhold som eluering styrken af kromatografi øges. Til dette formål forsøgte vi at kombinere de to tilgange for at opnå adskillelse af både lipid og ikke-lipid klasser af metabolitter inden for en enkelt analyse.
Her præsenterer vi en kromotografisk metode, der bruger en tredje mobil fase og muliggør en kombineret traditionel omvendt fase og lipidomics-passende kromatografimetode ved hjælp af en enkelt prøveforberedelse og en analytisk kolonne. Vi har vedtaget mange af de kvalitetskontrolforanstaltninger og datafiltreringstrin, der tidligere er blevet implementeret i overvejende kliniske metabolomundersøgelser. Disse tilgange er nyttige til bestemmelse af robuste egenskaber med høj teknisk reproducerbarhed og biologisk relevans og udelukker dem, der ikke opfylder disse kriterier. For eksempel beskriver vi gentagen analyse af den samlede QC prøve8, QC korrektion9, data filtrering9,10 og imputation af manglende funktioner11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne metode er velegnet til 30 prøver (ca. 150 frø pr. prøve). Her blev der anvendt tre biologiske replikater af ti forskellige markdyrkede hvedesorter.
1. Fremstilling af korn
- Prøver (fuldkorn) udtages fra -80 °C opbevaring.
BEMÆRK: Frysetørring af frø anbefales kort efter høst, hvis der indsamles prøver fra flere årstider. Dette minimerer eventuelle ændringer i metabolitkoncentrationen, der kan opstå efter varierende opbevaringsperioder. For at gøre dette, overføre frø til en 15 ml plast centrifuge rør (ca. 300 frø vil fylde røret) og dække med aluminiumsfolie. Pierce folien to-tre gange ved hjælp af en stift og fryse tørre hele korn natten (ca. 24 h). Prøverne kan enten returneres til fryseren -80 °C på dette tidspunkt, eller næste trin kan udføres. - Grind frøene ved hjælp af et laboratorium blender i to kørsler på høj tilstand i 20 s.
BEMÆRK: Den blender, der anvendes til denne protokol, kræver mindst ca. 150 frø for at fylde blenderen til klingehøjde og give en relativt homogent jordet kornprøve. - Fjern blenderen fra bunden, og bank på blenderens side for at bringe groft formalet korn op på prøveemnets overflade. Groft materiale kan kasseres eller opbevares.
- Overfør pulverlignende fintmalet materiale fra blenderen til et 2 ml mikrocentrifugerør af plast.
BEMÆRK: Blenderen vaskes med deioniseret vand, og skyl med MEOH i LC-MS-kvalitet mellem prøverne. Sørg for, at blenderen er helt tør, før du går videre til næste prøve. - Retur fint malede kornprøver til fryseren eller gå videre til næste trin (metabolitekstraktion).
2. Fremstilling af ekstraktionsopløsningsmiddel
BEMÆRK: Forbered ekstraktionsmidlet samme dag som udsugningen.
- Der fremstilles mindst 2 ml 1 mg/ml af hver standard. Brug acetonitril (ACN) til at fremstille 2-aminoanthracene, miconazol og d6-transcinnamic syre. Brug vand til at forberede 13C6-sorbitol.
- Der tilsættes 2 ml af hver 1 mg/ml-standard, og der tilsættes en 100 ml volumetrisk kolbe.
- Fyld den volumetriske kolbe til linjen med acetonitril. Sørg for, at 100 ml acetonitril indeholder 20 μg/ml af hver af de interne standarder: 2-aminoanthracene, miconazol, 13C6-sorbitol, d6-transcinnamic acid.
3. Metabolitekstraktion
- 200 mg fint malet korn vejes i et 2 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 500 μL ekstraktionsopløsningsmiddel til 200 mg fintmalet kornprøve.
- Bland ved hjælp af en homogenisator til 2 kørsler af 20 s ved 6.500 rpm.
- Der centrifugeres ved 4 °C i 5 min ved 16.100 x g.
- Overfør supernatanten til et 2 ml plastrør.
- Denne procedure gentages fra trin 3.1 til 3,5 to gange mere for at give et samlet supernatantvolumen på ca. 1,5 ml.
- Vortex at blande supernatant.
- Et tilsvarende volumen (55 μL) af hvert ekstrakt overføres til et separat 2 ml-rør for at lave en samlet prøve af kornekstrakt.
- En 50 μL prøve af ekstraktet overføres til et glasglas.
BEMÆRK: Ekstrakter kan fryses (-80 °C) på dette tidspunkt eller gå videre til næste trin og følge op til LC-MS-analysen.
4. Udarbejdelse af løsninger til LC-MS-analyse
FORSIGTIG: For koncentreret syre tilsættes altid syre til vand/opløsningsmiddel.
- Klargør 50 ml 1 M ammoniumformatsstamopløsning. 3,153 g ammoniumformat vejes og overføres til en 50 ml volumetrisk kolbe. Fyld volumetrisk kolbe på linjen med LC-MS klasse H2O.
- 1 L af den mobile fase A bestående af 10 mM ammoniumformat, 0,1% myresyre. For at gøre dette, tilsættes ca 500 ml LC-MS grade vand til en 1 L volumetrisk kolbe. Der tilsættes 10 ml 1 M ammoniumformat og 1 ml myresyre. Fyld volumetrisk kolbe til linjen med LC-MS grade H2O. Overførsel til en 1 L flaske og sonikere i 15 min til degas.
- Der fremstilles 1 L af den mobile fase B bestående af 10 mM ammoniumformat i 79:20:1 acetonitril:isopropylalkohol:vand, 0,1% myresyreforhold. Der tilsættes 200 ml isopropanol til en 1 L volumetrisk kolbe. Der tilsættes 10 ml 1 M ammoniumformat og 1 ml myresyre. Fyld volumetrisk kolbe til linjen med acetonitril. Overfør til en 1 L flaske og sonikere i 15 min til degas.
BEMÆRK: 1 M ammoniumformat fortyndes i isopropylalkoholen (IPA), før ACN tilsættes. Ammoniumformat er uopløseligt i CAN. - Der fremstilles 1 L af den mobile fase C bestående af 10 mM ammoniumformat i forholdet 89:10:1 isopropylalkohol:acetonitril:vand. For at gøre dette, tilsættes ca 500 ml isopropanol, 10 ml 1 M ammonium formate lager og 100 ml acetonitril til en 1 L volumetrisk kolbe. Fyld til linjen med isopropanol. Overfør til en 1 L flaske og sonikere i 15 min til degas.
- Klargøring af LC-MS-systemvaskeopløsningsmidler
- Udskift pumpehovedvaskeopløsningen med frisk opløsning. Brug 50% methanol, 10% isopropylalkohol eller andet som anbefalet af producenten.
- Der fremstilles stærke og svage nålevasksopløsninger til vask af injektionsvæskemidler før og efter injektion af prøver. For den stærke vask, tilsæt lige store mængder af ACN og IPA. Ved den svage vask fremstilles en opløsning på 10% ACN (der kræver ca. 500 ml og 1 L af hver af de stærke og svage vaske til henholdsvis denne protokol og antallet af prøver) i separate flasker.
- Indstil nålevaskevolumenerne til henholdsvis 600 μL og 1800 μL for de stærke og svage vaske.
5. Forberedelse af prøver til LC-MS-analyse
- I henhold til fabrikanternes standardprocedure for fremstilling af 400 NG/μL leucinenkephalin anbringes 7,5 ml vand i det 12 ml leucine-enkephalin-hætteglas, der indeholder 3 mg leucin-enkephalin. Fryseved -80 °C i 50 μL aliquots.
- Der fremstilles 100 ml 5% ACN indeholdende 200 ng/ml leucin-enkephalin (50 μL 400 ng/μL leucin enkephalin). Forbered dig på samme dag som LC-MS-analyse.
- Der tilsættes 950 μL 5% acetonitril indeholdende injektionsstandarden leucin-enkephalin til den 50 μL prøvealiquot, der er fremstillet fra trin 3.
- Vortex at blande den forberedte prøve.
6. LC-MS-opsætning
BEMÆRK: En detaljeret beskrivelse af opsætningen af instrument- og anskaffelsesmetoden er beskrevet i producentens brugervejledning. Nedenfor er der skitseret en generel vejledning og de nærmere oplysninger, der er specifikke for denne protokol. Følgende trin kan udføres når som helst, før dataene hentes.
- Åbn en LC-MS-hardwareprofil.
- Indstil den kromatografiske metode som beskrevet i tabel 1. Sørg for, at LC-systemet er udstyret med en kvaternære opløsningsmiddelleder til opsætning af denne gradient.
BEMÆRK: IPA er et tyktflydende opløsningsmiddel. Det bør indføres ved en lav strømningshastighed, og der bør anvendes en tilstrækkelig ligevægtstid, før sammensætningen øges til 98,0 %. Disse trin forhindrer LC-systemet i at overlægge og stoppe. - Konfigurer massespektrometeranskaffelsesmetoderne for hver af de positive og negative ToF-MS-tilstande over m/z-området 50-1.300.
BEMÆRK: Det instrument, der anvendes til det arbejde, der præsenteres her, kræver, at positive og negative metoder kalibreres og køres individuelt (dvs. polaritetsskift inden for en metode er ikke muligt). - Hvis LC-kolonnen er ny, skal kolonnen konditioneres i henhold til producentens anbefaling.
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres direkte før dataindsamling. - I en hardwareprofil, der kun er for alle, skal massespektrometeret kalibreres i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Gennemfør dette trin før hver anskaffelsesmåde, og sørg for, at systemet har stabiliseret sig i hver given modalitet før kalibrering.
- Rens og skyl LC fluidics-systemet ved hjælp af LC-MS-opløsningsmidler, herunder mobile fase- og vaskeopløsningsmidler.
- LC-systemet skal ækvilibreres ved hjælp af LC-metodens startbetingelser, hvilket sikrer, at kolonnetrykket er stabiliseret.
- Injicer natriumformat (0,5 mM i 90% IPA) i begyndelsen af prøvesekvensen (beskrevet nedenfor) for at kontrollere instrumentkalibreringen.
- Indstil instrumentsekvenstabellen, så opløsningsmiddel og præparative (ekstraktions) emner analyseres først. efterfulgt af poolede QC-prøver (6-10) til konditionering af systemet derefter køres den randomiserede stikprøveliste med QC-prøver med regelmæssige mellemrum (f.eks. hver femte injektion) som tekniske replikater. Kør to QC-prøver i slutningen af sekvensen.
BEMÆRK: Det er nyttigt at medtage dato- og injektions-/anskaffelsesordren i eksempelfilnavnet samt prøve-id'et. For eksempel: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological replikere. Før du trykker på start, skal du sikre dig, at LC-kolonnetrykket er stabilt, og at rembursen er tilsluttet MS.
7. Databehandling
BEMÆRK: En generel databehandlingsarbejdsgang præsenteres i figur 1.
- Kontroller datakvaliteten (intern standardmassenøjagtighed (beregning nedenfor) og signalgengivelse), mens sekvensen kører. For at kontrollere signalets reproducerbarhed er besigtigelse af overlejret spektre tilstrækkeligt.
BEMÆRK: Massefejl (ppm) = ((Teoretisk masse – målt masse) / teoretisk masse) x 106 - Generer en justeret matrix for maksimalintensitet, der indeholder prøver x interne standarder (justeret efter retentionstid og m/z-værdier).
- Åbn databehandlingssoftwaren (se Materialetabel). Klik på Data under Hjem > Åbn. Gå til den relevante filplacering, og åbn alle datafiler.
- Vælg Kvvantitation i rullemenuen under Startside > Sekvens > Behandlingstype.
- Klik på Kalibreringskomponenterunder Hjem > Metode > Quan. Udfyld hvert felt ved hjælp af oplysningerne i tabel 2. Klik på OK.
- Udfyld eksempeltypen i venstre panel i kolonnerne ud for datafilerne ved at højreklikke på cellen og vælge Ukendt. Udfyld niveauet som i/a.
- Vælg Sekvens under Startside > Behandling. Vælg en placering for at gemme sekvensen, og klik derefter på Proces.
- Vælg Quanunder Startside > Resultater. Vælg Eksporter kørsler til matrixanalysatori fremviseren af fremviseren.
- Klik på Eksporter til csvfra matrixanalyseresultatfremviser. Gem filen som en regnearksfil.
- I regnearkssoftware beregnes gennemsnit, standardafvigelse og relativ standardafvigelse for intensiteten (topområdet) for hver intern standard.
- Generer en justeret matrix for maksimalintensitet, der indeholder prøver x ikke-målrettede funktioner (justeret efter opbevaringstid og m/z-værdier).
- Åbn den lille molekyleregistreringsanalysesoftware (se Materialetabel),og vælg Filer > Ny for at oprette et nyt eksperiment. Navngiv eksperimentet, og vælg den placering, hvor eksperimentfiler skal gemmes og gemmes. Klik på Næste.
- Vælg den anvendte instrumenttype (massespektrometer med høj opløsning), dataformat (profil) og polaritet (positiv eller negativ). Klik på Næste. Vælg alle tilgængelige adducts i biblioteket, og rediger adduct-biblioteket efter behov. Klik på Opret eksperiment. Der indlæses en ny side, hvor resten af databehandlingen fortsætter/finder sted.
- Importer datafiler. Vælg filformatet, og vælg derefter import. Gå til dataplacering, og vælg de datafiler, der skal importeres. Status vil blive vist for hver fil på venstre panel af siden.
- Når datafiler er importeret, skal du vælge Start automatisk behandling. Vælg en metode til valg af en justeringsreference. Enten lad softwaren vurdere alle kørsler for egnethed, give en liste over egnede prøver (dvs. QC prøver) eller vælge den reference, der passer bedst, dvs en mid-sekvens QC prøve. Vælg Ja, juster automatisk mine kørsler > Næste.
- Vælg Næste på siden eksperimentdesign (dette kan konfigureres senere).
- Vælg Udfør toppluk, og angiv derefter parametre. Vælg Absolut ionintensitet under fanen Grænser for spidsvalg, og angiv 100. Vælg anvend en minimumtopbredde, og angiv 0,01 min. Vælg OK > Udfør. Når behandlingen er fuldført, skal du vælge Luk.
BEMÆRK: Grænserne for spidsvalg kan optimeres til andre datafiltyper efter behov. - Vælg Sektion fuldførtnederst til højre på skærmen . Gennemse justerede kørsler, og sørg for, at hvert eksempel er justeret efter referencen. Justeringsscorerne var >90 % for de data, der præsenteres her. Vælg Sektion fuldført.
- Vælg mellem motivdesign på næste side. Navngiv designet. Vælg Gruppér kørslerne manuelt og Opret design. Tilføj betingelse, klik på Betingelse 1 og navngive gruppen korrekt. Klik på Sektion fuldført.
BEMÆRK: Fortsæt med at tilføje betingelser efter behov for at bruge statistik i softwaren. Da vi kun brugte softwaren til at generere en ikke-målrettet matrix, brugte vi en enkelt tilstand mærket 'all'. - Vælg Sektion fuldførtpå næste side . Må ikke re-do peak picking.
- Gennemse deconvolutionen, og klik derefter på Sektion fuldført.
- Gå til Filer > Eksporter sammensatte målinger. Fravælg de egenskaber, der ikke er ønsket i outputtet. Klik på OK. Vælg en placering for at gemme .csv-filen. Klik på Gem > Åbn fil > Åbn mappe eller Luk.
- Filtrer dataene ved hjælp af udtræksemnerne for at fjerne artefakter (regnearkssoftware).
- For hver RT x m/z-funktion beregnes den gennemsnitlige respons i udtræksemner i en ny kolonne.
- For hver RT x m/z-funktion beregnes den gennemsnitlige respons i alle andre prøver (herunder QC-prøver).
- Disstørste intensitet af blindprøver beregnes i prøver (gennemsnitlig respons ved blind/gennemsnitlig respons i prøver x 100).
- Sorter procentbidragskolonnen fra laveste til højeste værdier.
- Fjern funktioner, der har >5% intensitet bidrag fra blanke.
- Filtrer manglende værdier, og ret funktionssignalerne til signaler i samlede QC-prøver.
- Åbn databehandlingssoftwaren (Materialetabel). Klik på knappen Vis MatrixAnalyzer. Klik på knappen Åbn datafil.
- Gå til .csv-filplaceringen, der indeholder topintensiteten for RT x m/z-funktioner for hver prøve (ikke-målrettet matrix). Vælg Åbn.
- Udfyld hver parameter efter behov under fanen QC-prøver. For det datasæt, der er beskrevet her, skal du bruge QC category=QC, ignorere categories=empty, tilregne type=none, dækningstærskel=80, skalere ved hjælp af=ingen skalering, fjerne markeringen i logtransformering, korrekt brug=udjævning spline, udjævning=0,25.
- Klik på afspilningsknappen QC-korrektionøverst til højre i matrixpanelet.
- Når rettelsen er udført øverst til højre i matrixpanelet, skal du klikke på Gem resultater. Gå til en passende placering, og gem .csv-resultatfilen.
- Filtrer dataene for at fjerne funktioner, der har >20% RSD i QC-eksempler.
- Arranger dataene, så eksemplerne er i rækker, og funktionerne findes i kolonner.
- I en ny kolonne skal du beregne den gennemsnitlige spidsintensitet for QC-prøver.
- I en ny kolonne beregnes standardafvigelsen for spidsintensiteten for QC-prøver.
- Den relative standardafvigelse for spidsintensiteten for QC-prøver beregnes: (QC-standardafvigelse/QC-gennemsnit) x 100.
- Sorter funktionerne fra laveste til højeste %RSD, og fjern funktioner, der har en QC RSD >20%.
- Filtrer dataene for at fjerne funktioner med laveRSD-prøve/RSDQC-forhold (f.eks.
- I en ny kolonne skal du beregne den gennemsnitlige spidsintensitet for prøver.
- I en ny kolonne beregnes standardafvigelsen for spidsintensiteten for prøver.
- Den relative standardafvigelse for prøvernes topintensitet beregnes: (prøvestandardafvigelse/prøvegennemsnit) x 100.
- I en ny kolonne skal du opdele prøverne ssD ved QC RSD.
- Sorter værdierne (RSD-eksempel /RSDQC-forhold) fra højeste til laveste, og fjern funktioner med et forhold <1.sample
- Imæsion manglende værdier (flere metoder tilgængelige online).
- Formatere regnearket, så eksemplerne er i rækker og funktioner, der findes i kolonner. Den første kolonne skal være eksemplernefilnavnet. Opret en ekstra kolonne ud for filnavne, og angiv eksempelgrupperingerne. I dette tilfælde blev prøverne grupperet efter sort.
- Gem regnearket som en .csv-fil.
- Gå til hjemmesiden for den webbaserede analytiske pipeline for metabolomics med høj overførselsmængde (se Materialetabel),og klik på Klik her for at starte.
- Klik på Statistisk analyse. Vælg Datatype under Overfør dine data:tabel med maksimal intensitet, Format: Eksempler i rækker (ikke-parret) og vælg derefter Fil.
- Gå til .csv-fil, vælg Åbn, og vælg derefter Send.
- Vælg Manglende værdiforkalkulationpå næste side. Fjern markeringen i trin 1 (dette blev udført i AnalyzerPro XD). I trin 2 skal du vælge en metode til at estimere manglende værdier.
BEMÆRK: For de data, der præsenteres her - 'skøn manglende værdier' med 'KNN' blev valgt. - På dette stadium kan datamatrixen downloades (vælg Hent fra venstre panel på websiden) eller fortsætte med at udføre yderligere statistiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Planten metabolom er påvirket af en kombination af sit genom og miljø, og derudover i en landbrugsmæssig indstilling, afgrødeforvaltning regime. Vi viser, at genetiske forskelle mellem hvedesorter kan observeres på metabolitniveau, her, med over 500 målte forbindelser, der viser signifikant forskellige koncentrationer mellem sorter i kornet alene. Der blev observeret god massenøjagtighed (<10 ppm-fejl) og signalreproducerbarhed (<20% RSD) af interne standarder (figur 2) for både negative og positive ioniseringstilstande (tabel 3). Den beskrevne prøveforberedelse og væskekromatografi-massespektrometribaserede analyse gav >900 deconvoluted features i negativ ioniseringstilstand og >1300 deconvoluted features i positiv ioniseringstilstand. Præparative emner (figur 3) blev medtaget for at afgøre, om prøveforberedelses- og analysemetoderne indførte artefaktegenskaber og dermed alle ikke-biologiske påvirkninger, der er fjernet fra datamatrixen. Det blev konstateret, at 421 signaler i negativ tilstand og 835 signaler i positiv tilstand havde signalintensiteter svarende til eller større end 5% af den gennemsnitlige signalintensitet i kornprøver. Disse funktioner blev fjernet, og efter yderligere data filtrering trin (trin 7 og Figur 1), den negative tilstand returneres 483 funktioner og den positive tilstand returneres 523 funktioner, danner den metaboliske øjebliksbillede. Metoden var vellykket til at opdage funktioner, som havde væsentligt forskellige intensiteter mellem hvede sorter (Figur 4) med > 500 væsentlige funktioner på tværs af begge ionisering stilstande. I negativ ioniseringstilstand var størstedelen af de væsentlige træk i den omvendte fasegradient, og i positiv ioniseringstilstand var størstedelen af de væsentlige funktioner i lipidgradienten (figur 4).
Figur 1: Den arbejdsproces, der bruges i denne analyse til datakontrol, -behandling og -filtrering. Trin 1 udføres ved hjælp af software til dataindsamling/visning på instrumentet, således at der kan foretages "on-the-fly"-vurderinger. Dette omfatter beregning af massefejl (ppm) af interne standarder og overlejring af interne standardtoppe til visuel vurdering af datareproducerbarhed. Trin 2-7 beskriver den databehandlingsprocedure, der er beskrevet i protokollen, trin 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ekstraherede ionkromatogrammer. Ekstraheret ionkromatogrammer af 13C6-sorbitol (mørkeblå), leucin-enkephalin (pink), d6-trans-cinnamic syre (orange), 2-aminoanthracene (grøn) og miconazol (lyseblå) interne standarder i positive (top) og negative (nederste) elektrospray ionisering (ESI) tilstande. De interne standardretentionstider og intensiteter vises. ESI + og ESI - Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samlet ionkromatogram (TIC) overlejring af præparative emner, der viser negativ tilstand (pink) og positive tilstand (blå) erhvervelser. En intern standard, miconazol, er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Samlet ionkromatogram (TIC) overlejring, der viser negative tilstand (pink) og positive tilstand (blå) erhvervelser og antallet af funktioner væsentligt forskellige mellem hvede sort på tværs af kromatografiske gradient. I negativ tilstand blev det største antal væsentlige funktioner fundet, da den mobile fase B-sammensætning var høj. I positiv tilstand blev det største antal væsentlige funktioner fundet, da den mobile fase C-sammensætning var høj. En intern standard, miconazol, er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Segment | Tid | Flowhastighed | %A | %B | %C | Kurve |
| (min) | (mL/min) | |||||
| 1 | Første | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabel 1: Tidstimeprogram for væskekromatografi af mobile fasesammensætninger.
| Parameter | Intern standard | ||||
| kr. C6-sorbitol | Leucin-enkephalin | d6-transcinnamic syre | 2-amino-anthracene | Miconazol | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Massetolerance (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Opbevaringstid | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Vinduet Opbevaringstid | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Registreringstype | Højeste | Højeste | Højeste | Højeste | Højeste |
| Svartype | Område | Område | Område | Område | Område |
| Områdetærskel | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Grænse for bredde | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Højdetærskel | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Signal-til-støj-forhold | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Udjævning | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabel 2: Peak detektionsparametre for interne standarder i positive (og negative) anskaffelsestilstande.
| Massenøjagtighed (ppm) | %RSD før QC-korrektion | %RSD Efter QC-korrektion | ||
| Negativ tilstand | kr. C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-transcinnamic syre | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucin-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Positiv tilstand | kr. C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucin-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-transcinnamic syre | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazol | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabel 3: Prøve (n=30) intern standardmassenøjagtighed (ppm) og signalreproducerbarhed før og efter QC-korrektion udtrykt som relativ standardafvigelse (%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en LC-MS-baseret ikke-målrettet metabolomics metode til analyse af hvedekorn. Metoden kombinerer fire anskaffelsestilstande (omvendt fase og lipid-modtagelig omvendt fase med positiv og negativ ionisering) i to tilstande ved at indføre en tredje mobil fase i den omvendte fasegradient. Den kombinerede metode gav ca. 500 biologisk relevante træk pr. ionpolaritet, idet ca. halvdelen af disse var væsentligt forskellige i intensitet mellem hvedesorter. Væsentlige ændringer i metabolitkoncentrationen i kornet af forskellige hvedesorter indikerer ændret biokemi, som kan være forbundet med sygdomsresistens, stresstolerance og andre fænotypiske træk, der er vigtige for kornkvalitet og udbytte. For eksempel, metabolomics tilgange er blevet brugt til at beskrive nye forsvarsmekanismer12 og foreslå den rolle, metabolitter i tørke tolerance13. Fremtidige anvendelser af denne protokol kan være i stand til yderligere at forbinde biokemiske profiler af bestemte sorter med genetiske egenskaber, der er ønskelige for visse miljøer og forvaltningspraksis. Til gengæld ville dette give mulighed for produktion af optimal kornkvalitet og udbytte for udvalgte genotyper.
Medtagelsen af interne standarder er afgørende for denne protokol for at give brugeren mulighed for at bestemme ændringer i signal, fastholdelsestid skift og som indikatorer for masse nøjagtighed. Ændringer i signalet kan for eksempel indikere suboptimal ekstraktion, injektion (herunder fluidic system blokeringer) eller detektor ydeevne. Fastholdelsestidskift kan indikere dårlig pumpeydelse, uhensigtsmæssig hesteledning af mobil fasegradient, eller at lc-kolonnens stationære fase er blevet forringet. Dårlig massenøjagtighed kan være tegn på en dreven kalibrering, og at systemet kræver rekalibrering. I alle ovennævnte tilfælde skal systemet stoppes, og der skal udføres passende vedligeholdelse/udskiftning af dele. Vi medtog fire standarder i den ekstraktionsopløsning, der blev brugt til fremstilling af korn, og en standard i den endelige prøve, der blev tilsat før injektionen. Der blev sørget for, at standarderne var modtagelige for hver ioniseringstilstand og dækkede en række retentionstider; Vi anerkender dog, at denne vifte af standarder kan forbedres med inddragelse af en mærket lipidstandard. Det har vist sig, at hvedekorn indeholder hundredvis af triacylglyceroler (TAGs)5, hvoraf alle ville være en passende tilføjelse til denne protokol. Medtagelsen af præparative emner og poolede QC-prøver8 er også kritiske trin i denne protokol. Tusindvis af ionfunktioner påvises i ikke-målrettede massespektrometrimetoder, og det er vigtigt at udelukke dem, der kun findes i blindprøver, og også dem, der ikke registreres reproducerbart (dvs. høj %RSD) under hele analysen.
Selv om den nuværende metode sparer lang tid og ressourcer, hvis en kvaternære opløsningsmiddel manager ikke er tilgængelig, standard omvendt fase og lipid metoder kan bruges til at opnå de samme resultater. Den ekstraktionsmængde, der anvendes i denne protokol, ville være tilstrækkelig til at analysere yderligere anskaffelsesmetoder. Denne protokol beskriver en acetonitril ekstraktion. Selv om det lykkes, vil et alternativt ekstraktionsmiddel eller en kombination af opløsningsmidler give en anden metabolitdækning, hvilket igen kan give flere funktioner og/eller give nogle forbindelser bedre (eller mindre) ekstraktionseffektivitet. Vi har ikke forsøgt at fastslå metabolitidentiteten af de statistisk signifikante målinger, der er blevet løst i denne protokol. Der findes imidlertid massespektrale databaser for plantemetabolitter og lipider , som udvikler5,14,15. For at identificere metabolitterne skal der indsamles tandemmassespektre (MS/MS) ud over fuldstændige scanningsdata. Disse kan indsamles under den indledende kørsel ved hjælp af samleprøver og en passende MS/MS-metode eller på reserveret ekstrakt (opbevaret ved -80 °C), når der er fastlagt metabolitter af interesse. Vi observerede store fold ændringer af forbindelser mellem sorter, så vi vil anbefale at gøre både og i anden omgang, ved hjælp af en sort kendt for at indeholde en høj koncentration af den sammensatte interesse for at opnå den højeste kvalitet MS / MS spektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende West Australian Premier's Landbrug og Fødevarer Fellowship program (Department of Jobs, Turisme, Videnskab og Innovation, regeringen i Western Australia) og Premier's Fellow, professor Simon Cook (Center for digitalt landbrug, Curtin Universitet og Murdoch Universitet). Feltforsøg og kornprøve indsamling blev støttet af regeringen i Western Australia's Royalties for Regioner program. Vi anerkender Grantley Stainer og Robert French for deres bidrag til feltforsøg. Den NCRIS-finansierede Bioplatforms Australien er anerkendt for finansiering af udstyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
