在全融合微流体平台中增强患者衍生异种移植物的外体 3D 水凝胶培养物的生存能力
Summary
该协议演示了启用患者衍生异种移植 （PDX） 的扩展体外培养的方法。通过直接去除不可行的单细胞，一步提高三维水凝胶中多细胞聚类培养的整体生存能力。辅助步骤演示了在全融合微流体平台中 PDX 培养的最佳实践。
Abstract
患者衍生的异种移植物（PDX），当被切除的患者肿瘤组织被直接移植到免疫功能低下的小鼠中时产生，在生物学上保持稳定，从而保留分子、遗传和组织学特征，以及原始肿瘤的异质性。然而，使用这些模型进行大量的实验，包括药物筛选，在成本和时间方面都是令人望而却步的。三维（3D）培养系统被广泛视为癌细胞通过生化相互作用、形态学和建筑保持其生物完整性的平台。我们的团队使用由透明质酸 （HA） 组成的 3D 基质在体外培养 PDX 细胞方面拥有丰富的经验。为了分离与PDX相关的小鼠成纤维细胞，我们使用旋转培养，其中频闪细胞粘附在组织培养治疗板的表面，而分离的PDX肿瘤细胞漂浮和自联成多细胞簇。也漂浮在上流液是单，往往是死细胞，这提出了一个挑战，收集可行的PDX集群下游封装到水凝胶的3D细胞培养。为了将这些单细胞与活细胞簇分离，我们采用了密度步进梯度离心。此处描述的协议允许将不可行的单细胞从细胞群的健康群体中耗尽，这些细胞群将用于进一步的体外实验。在我们的研究中，我们将 3D 培养物融入微流体板中，从而在培养过程中进行介质灌注。在使用纯化细胞与非纯化细胞的荧光图像可行性测定评估结果培养物后，我们的结果表明，这一额外的分离步骤大大减少了来自我们培养物的非活细胞的数量。
Introduction
在过去的十年中，癌症研究领域已经显示出对患者衍生异种移植（PDX）作为评估癌细胞通路依赖和药物易感性1的工具的新的热情。最常见的PDX模型通过人类肿瘤细胞的皮下或正畸植入建立——肿瘤片段、分离肿瘤衍生细胞群或分离循环肿瘤细胞样本——进入啮齿动物宿主体内。如果肿瘤”服用”成功，异种移植细胞将增殖，血管化，或以其他方式与宿主组织相互作用，形成肿瘤，可以收获的最佳大小，细分，并重新植入到其他宿主。作为模型系统，PDX在众多优点中通常保留了原生肿瘤细胞种群的异质性，并能够评估人类特异性通路和细胞反应2,2、3。体内语境允许肿瘤与血管和其他相邻频闪体相互作用，并回顾组织特征，如药物扩散动力学、氧气张力和细胞外基质影响，从而影响肿瘤进展。PDX 的一个负面方面是它们依赖啮齿动物宿主，这既是肿瘤扩张，也是最终的假设检验。由于许多PDX无法适应传统的二维（2D）培养组织培养聚苯乙烯而不失去许多理想的特征，因此，在这种方法相对可控的体外方法与体内PDX使用费用、设施和时间要求显著增加之间，研究人员的中间地带微乎其微。
我们描述了多个体外模型，在支持矩阵中实现3D细胞培养，最近扩展了该工作，以证明多种前列腺癌（PCa）衍生PDX的外活培养，单独和与骨髓衍生的成纤维细胞44，5联合培养。基于透明质酸 （HA） 水凝胶基质为两种细胞类型提供可定制且与生物学相关的支持，通过水凝胶深度 6 对水凝胶特性和光学清晰度进行简单控制，用于成像。
成熟的PDX肿瘤组织包括异质人类癌细胞和小鼠频闪（成纤维细胞、内皮细胞等）的可变混合物。研究细胞型对体外肿瘤进展的具体贡献，有利于分离肿瘤，分离细胞群，并以有组织的方式进行实验合并，以解剖细胞间交流的通路。组织消化中的混合细胞群与特定培养条件具有差异性相容性。例如，肿瘤相关的成纤维细胞生存能力需要表面粘附或3D基质与整黄素配体功能化，而上皮衍生PDX细胞通常没有这些要求，而是倾向于细胞-细胞相互作用。这些差异可以被利用，以实现PDX细胞与污染小鼠频闪细胞的有效分离。组织消化的旋转培养允许频闪细胞粘附于组织培养表面，而细胞粘附驱动PDX细胞漂浮在旋转培养表面之上，在24~48小时内在上半部分形成多细胞簇。这些聚类的具体特性因 PDX 而异（例如，大、紧、高球形聚类或类似葡萄束的更小、更松散的聚集体），但通常具有生物相关尺寸（直径为 50–250 μm），足以评估依赖于细胞间接触的细胞相互作用。
肿瘤检索和处理不可避免地导致某种程度的附带细胞死亡，要么是由于机械/酶中断造成的短期损害，要么是亚细胞与所选培养条件的长期不相容。尽管旋转培养作为初始批量分离的效用，但死细胞或垂死的细胞不可避免地会随着PDX簇而转移，并会影响由此产生的培养。这些死细胞通常是单个PDX细胞，没有集成到一个集群，小鼠频闪成纤维细胞，不能在选定的培养条件下生存，或特别脆弱的内皮细胞。这种垂死的细胞可以影响”幸存者”的实验结果，并可以极大地影响定量，例如，通过荧光图像的生存能力筛查测定。为了改进从此方法中选择活的PDX细胞，我们采用离心方法，采用密度步骤，以轻松去除PDX混合物中的单个死/死细胞，并保留主要活体多细胞簇。
为了加强对3D培养中PDX衍生聚类的研究，我们利用了一个基于微流体的灌注培养平台，即有机板（图1），这是一个高通量的有机体片平台，允许在384孔微刺激板基上同时培养多达96个个体灌注、3D培养基（图,81A）7。7在双通道微流体板中，单个组织芯片通过两个微流体通道（图1B，凝胶通道：红色，灌注通道：蓝色）连接，连续跨越四个孔。两个微流体通道由一个称为相位导的短塑料脊隔开，防止一个通道溢出到相邻的相邻通道中，同时允许在凝胶的内容和灌注通道9之间实现无膜接口。由于微流体板的底部由显微镜级玻璃组成，因此可以通过标准或自动显微镜在观察窗口通过检查窗口查看。灌注是在微流体板与可编程摇臂，利用重力驱动介质通过微流体通道，在储层井之间（图1C）。灌注流模仿比静态培养更密切地概括肿瘤微环境，允许合并剪切应力和增强气体和营养物质的分布。与相同细胞的静态3D培养物相比，在微流体板中维持高融合癌细胞培养的好处以前被描述为高融合乳腺癌培养物表现出最佳的生存能力。
本报告介绍了一种用于隔离活多细胞PDX聚类的适应密度梯度离心方法，并展示了其在可测量微流体板内建立3D PDX培养物的效用。由于越来越多的研究实验室正在寻求促进 PDX 使用的方法，我们预计此处介绍的协议将立即具有实用价值。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了一种在高通量、注入三D培养系统中处理和培养可行的PDX衍生肿瘤细胞的方法。虽然该协议利用PCa PDX组织，它同样有效的其他上皮衍生肿瘤。肿瘤特征在单个 PDX 线之间有所不同，即使在同一原点组织（前列腺、乳房等）内。一些PCa PDX线是更多的纤维化和难以分离可行的细胞，而其他更多的细胞。此处指出的肿瘤大小可以在 IACUC 指南中变化，为特别低产的肿瘤提供更多的组织?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院国家癌症研究所SBIR第一期（HHSN26120700015C）和P01CA098912的支持。
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
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