Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform
Summary
Denne protokol demonstrerer metoder til at muliggøre udvidet in vitro-kultur af patientafledte xenografts (PDX). Et skridt øger den samlede levedygtighed af flercellede klyngekulturer i 3D-hydrogels ved simpel fjernelse af ikke-levedygtige enkeltceller. Et sekundært trin demonstrerer bedste praksis for PDX-kultur i en perfunderet mikrofluidisk platform.
Abstract
Patient-afledte xenografts (PDX), genereret, når resected patient tumorvæv er indskrevet direkte i immunkompromitterede mus, forblive biologisk stabil, og dermed bevare molekylære, genetiske, og histologiske træk, samt heterogenitet af den oprindelige tumor. Men ved hjælp af disse modeller til at udføre en lang række eksperimenter, herunder narkotika screening, er uoverkommelige både med hensyn til omkostninger og tid. Tre-dimensionelle (3D) kultursystemer er bredt betragtet som platforme, hvor kræftceller bevarer deres biologiske integritet gennem biokemiske interaktioner, morfologi, og arkitektur. Vores team har stor erfaring med at dyrke PDX-celler in vitro ved hjælp af 3D-matricer, der består af hyaluronsyre (HA). For at adskille musefibroblast stromale celler forbundet med PDX’er, bruger vi rotationskultur, hvor stromale celler klæber til overfladen af vævskulturbehandlede plader, mens dissocierede PDX-tumorceller flyder og forbinder sig selv i flercellede klynger. Også flydende i supernatant er enkelt, ofte døde celler, som udgør en udfordring i indsamlingen levedygtige PDX klynger til downstream indkapsling i hydrogels for 3D-celle kultur. For at adskille disse enkelte celler fra levende celle klynger, har vi ansat densitet trin gradient centrifugering. Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for udtømning af ikke-levedygtige enkeltceller fra den sunde population af celleklynger, der vil blive brugt til yderligere in vitro-eksperimenter. I vores undersøgelser inkorporerer vi 3D-kulturer i mikrofluidiske plader, som giver mulighed for medieperfusion under kulturen. Efter at have vurderet de resulterende kulturer ved hjælp af en fluorescerende billedbaseret levedygtighedsanalyse af renset versus ikke-rensede celler, viser vores resultater, at dette yderligere adskillelsestrin reducerede antallet af ikke-levedygtige celler fra vores kulturer betydeligt.
Introduction
I løbet af det seneste årti, inden for kræftforskning har vist fornyet begejstring for patient-afledte xenografts (PDXs) som et redskab til vurdering af kræft celle vej afhængighed og narkotika modtagelighed1. De mest almindelige PDX modeller er etableret ved subkutan eller ortotopisk implantation af menneskelige tumorceller-en tumor fragment, en klynge af dissocierede tumor-afledte celler, eller en prøve af isolerede cirkulerende tumorceller (CTC’er) -i en gnaver vært. Hvis tumoren “tage” er en succes, xenograft celler vil formere sig, vaskularisere, og ellers interagere med værten væv til at skabe en tumor, som kan høstes på en optimal størrelse, opdelt, og re-implanteret i andre værter. Blandt deres mange fordele som model system, PDXs typisk bevare en betydelig del af den indfødte tumor celle befolkningens heterogenitet og muliggøre vurderingen af human-specifikke veje og celle svar2,3. In vivo-konteksten muliggør tumorinteraktion med vaskulatur og andre tilstødende stroma og opsummerer vævsegenskaber såsom lægemiddeldiffusionsdynamik, iltspænding og ekstracellulær matrix indflydelse, der biologisk og mekanisk påvirker tumorprogression. Et negativt aspekt af PDXs er deres afhængighed af en gnaver vært, både for tumor ekspansion og i sidste ende for hypotese test. Fordi mange PDXs ikke kan tilpasse sig traditionelle to-dimensionelle (2D) kultur på vævskultur polystyren uden at miste mange af deres ønskelige egenskaber, har der været minimal mellemvej for forskere mellem denne relativt kontrollerede in vitro-metode, og den betydelige stigning i bekostning, faciliteter og tidskrav til in vivo PDX brug.
Vi har beskrevet flere in vitro-modeller, der gennemfører 3D-cellekultur inden for en støttende matrix, og for nylig udvidet dette arbejde for at demonstrere ex vivo kultur flere prostatakræft (PCa)-afledte PDXs, både alene og i co-kultur med knoglemarv-afledte fibroblaster4,5. Hyaluronsyre (HA)-baserede hydrogelmaskrømme giver brugerdefinerbar og biologisk relevant støtte til begge celletyper med letkøbskontrol over hydrogelegenskaber og optisk klarhed for billeddannelse gennem hydrogeldybden6.
Ældre PDX tumorvæv omfatter en variabel blanding af heterogene humane kræftceller og mus stroma (fibroblaster, endotelceller, osv.). At studere celle-type specifikke bidrag til tumor progression in vitro, Det kan være en fordel at adskille tumorer, adskille cellepopulationer, og eksperimentelt indarbejde dem på en organiseret måde at dissekere veje intercellulære kommunikation. De blandede cellepopulationer i vævsgravere har differentialkompatibilitet med specifikke kulturbetingelser. For eksempel, tumor-associeret fibroblast levedygtighed kræver enten overflade tilslutning eller 3D matricer funktionaliseret med integrin ligands, mens epitel-afledte PDX celler ikke typisk har disse krav, i stedet favorisere celle-celle interaktioner. Disse forskelle kan udnyttes til at opnå effektiv adskillelse af PDX celler fra forurenende mus stromale celler. Rotationskultur af vævssideestater gør det muligt at danne stromale celletilhold til vævskulturoverfladen, mens cellecellevoksninger driver PDX-celler, der flyder over den roterende kulturoverflade for at danne flercellede klynger i supernatanten i 24-48 h. Disse klyngers særlige karakteristika varierer med PDX (f.eks. store, stramme, meget sfæriske klynger eller mindre, løsere aggregater, der ligner bundter af druer), men er typisk af biologisk relevante størrelser (50-250 μm diameter), der er tilstrækkelige til at vurdere cellulære interaktioner, der er afhængige af intercellulære kontakter.
Tumor hentning og behandling uundgåeligt resulterer i en vis grad af sikkerhedsstillelse celledød, enten på grund af kortsigtede skader fra mekanisk / enzymatisk forstyrrelser, eller langsigtet uforenelighed af delpopulationer med de valgte kulturbetingelser. På trods af nytten af rotation kultur som en indledende bulk adskillelse, døde eller døende celler er uundgåeligt overføres med PDX klynger og kan påvirke den deraf følgende kultur. Disse døde celler er ofte individuelle PDX celler, der ikke var integreret i en klynge, mus stromale fibroblaster, der ikke kan overleve i udvalgte kulturbetingelser, eller særligt skrøbelige endotelceller. Sådanne døende celler kan påvirke eksperimentelle resultater fra “overlevende” og kan i væsentlig grad påvirke kvantificering, f.eks. For at forbedre udvælgelsen af levende PDX-celler fra denne metode tilpassede vi centrifugeringsmetoder med tæthedstrin for nemt at fjerne individuelle døde/døende celler fra PDX-blandinger og bevare overvejende levende flercellede klynger.
For at forbedre studiet af resulterende PDX-afledte klynger i 3D-kultur, vi udnyttede en microfluidics-baserede perfusion kultur platform, OrganoPlate (Figur 1), som er en høj-throughput organ-on-a-chip platform, der giver mulighed for samtidig kultur på op til 96 individuelle perfunderes, 3D kulturer på en 384-godt microtiter plade-base (Figur 1A)7,8. I den 2-lane mikrofluidic plade, en enkelt væv chip er forbundet med to microfluidic kanaler(Figur 1B,gel kanal: rød, perfusion kanal: blå), som spænder over fire brønde i træk. De to mikrofluidiske kanaler er adskilt af en kort plastik højderyg kaldet en Phaseguide, som forhindrer overløb af en kanal i sin tilstødende nabo kanal, og samtidig giver mulighed for en membran-fri grænseflade mellem indholdet af gel og perfusion kanal9. Fordi bunden af mikrofluidic plade er sammensat af mikroskop-grade glas, kan kulturerne ses i observationsvinduet gennem bunden af pladen med en standard eller automatiseret mikroskop. Perfusion er etableret i den mikrofluidiske plade med en programmerbar rocker, ved hjælp af tyngdekraften til at drive medier gennem de mikrofluidiske kanaler, mellem reservoir brønde (Figur 1C). Den perfusion flow-efterligner tættere opsummerer tumor mikromiljø end statisk kultur, giver mulighed for inkorporering af forskydningsstress og forbedret fordeling af gasser og næringsstoffer. Fordelene ved at opretholde en perfunderet kræftcellekultur i mikrofluidic-pladen er tidligere blevet beskrevet som perfunderes brystkræft kulturer udstillet optimal levedygtighed i forhold til en statisk 3D-kultur af de samme celler7.
Denne rapport beskriver en tilpasset tæthedsgradientcentrifugeringsmetode til isolering af levende flercellede PDX-klynger og demonstrerer dens anvendelighed til at etablere 3D PDX-kulturer inden for perfusable mikrofluidiske plader. Fordi et stigende antal forskningslaboratorier søger metoder til at lette PDX brug, forventer vi, at de protokoller, der præsenteres her, vil være af umiddelbar nytte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode til behandling og dyrkning levedygtige PDX-afledte tumorceller i et høj-gennemløb, perfunderet 3D-kultursystem. Mens denne protokol udnytter PCa PDX væv, Det er lige så effektiv for andre epitel-afledte tumorer. Tumor egenskaber varierer mellem de enkelte PDX linjer selv inden for samme væv af oprindelse (prostata, bryst, osv.). Nogle PCa PDX linjer er mere fibrotiske og vanskelige at isolere levedygtige celler fra, mens andre er mere cellulære. Tumoren størrelse bemærkes her kan varier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Fase I (HHSN26120700015C) og P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
