Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform
Summary
Dieses Protokoll zeigt Methoden, um eine erweiterte In-vitro-Kultur von patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) zu ermöglichen. Ein Schritt verbessert die Gesamtlebensfähigkeit von mehrzelligen Clusterkulturen in 3D-Hydrogelen durch die einfache Entfernung nicht lebensfähiger Einzelzellen. Ein sekundärer Schritt veranschaulicht Best Practices für PDX-Kultur in einer durchsetzten mikrofluidischen Plattform.
Abstract
Patienten-abgeleitete Xenografts (PDX), die entstehen, wenn resektiertes Tumorgewebe des Patienten direkt in immungeschwächte Mäuse eingepfropft wird, bleiben biologisch stabil, wodurch molekulare, genetische und histologische Merkmale sowie Heterogenität des ursprünglichen Tumors erhalten bleiben. Die Verwendung dieser Modelle zur Durchführung einer Vielzahl von Experimenten, einschließlich des Drogenscreenings, ist jedoch sowohl in Bezug auf die Kosten als auch auf die Zeit unerschwinglich. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme werden weithin als Plattformen betrachtet, in denen Krebszellen ihre biologische Integrität durch biochemische Wechselwirkungen, Morphologie und Architektur behalten. Unser Team verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Kultivierung von PDX-Zellen in vitro mit 3D-Matrizen aus Hyaluronsäure (HA). Um mit PDXs assoziierte Maus-Fibroblasten-Stromalzellen zu trennen, verwenden wir Rotationskultur, bei der Stromalzellen an der Oberfläche von gewebekulturbehandelten Platten haften, während dissoziierte PDX-Tumorzellen schweben und sich selbst zu multizellulären Clustern verbinden. Ebenfalls im Überstand schweben einzelne, oft abgestorbene Zellen, die eine Herausforderung darstellen, lebensfähige PDX-Cluster für die nachgeschaltete Verkapselung in Hydrogele für die 3D-Zellkultur zu sammeln. Um diese Einzelzellen von lebenden Zellclustern zu trennen, haben wir die Zentrifuge des Dichteschrittgradienten eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erschöpfung nicht lebensfähiger Einzelzellen aus der gesunden Population von Zellclustern, die für weitere In-vitro-Experimente verwendet werden. In unseren Studien integrieren wir die 3D-Kulturen in mikrofluidische Platten, die eine Mediendurchblutung während der Kultur ermöglichen. Nach der Bewertung der resultierenden Kulturen unter Verwendung eines fluoreszierenden bildbasierten Lebensfähigkeits-Assays von gereinigten versus nicht gereinigten Zellen zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser zusätzliche Trennungsschritt die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen aus unseren Kulturen erheblich reduziert hat.
Introduction
In den letzten zehn Jahren hat der Bereich der Krebsforschung eine erneute Begeisterung für patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) als Instrument zur Beurteilung der Abhängigkeit von Krebszellsignalen und der Arzneimittelanfälligkeit1gezeigt. Die gängigsten PDX-Modelle werden durch subkutane oder orthotopische Implantation menschlicher Tumorzellen – ein Tumorfragment, ein Cluster dissoziierter Tumorzellen oder eine Probe isolierter zirkulierender Tumorzellen (CTCs) – in einen Nagetierwirt etabliert. Wenn der Tumor “nehmen” erfolgreich ist, vermehren sich die Xenograft-Zellen, vermehren sich und interagieren auf andere Weise mit dem Wirtsgewebe, um einen Tumor zu erzeugen, der in einer optimalen Größe geerntet, unterteilt und wieder in andere Wirte eingepflanzt werden kann. Unter ihren vielen Vorteilen als Modellsystem behalten PDXs in der Regel einen wesentlichen Teil der Heterogenität der nativen Tumorzellpopulation bei und ermöglichen die Beurteilung von humanspezifischen Bahnen und Zellreaktionen2,3. Der in vivo-Kontext ermöglicht die Tumorinteraktion mit vaskulaturundig und anderen angrenzenden Stroma und rekapituliert Gewebeeigenschaften wie Arzneimitteldiffusionsdynamik, Sauerstoffspannung und extrazelluläre Matrixbeeinflussen, die die Tumorprogression biologisch und mechanisch beeinflussen. Ein negativer Aspekt von PDXs ist ihre Abhängigkeit von einem Nagetier-Wirt, sowohl für die Tumorexpansion als auch letztlich für Hypothesentests. Da sich viele PDX nicht an die traditionelle zweidimensionale (2D) Kultur auf Gewebekultur-Polystyrol anpassen können, ohne viele ihrer wünschenswerten Eigenschaften zu verlieren, gibt es für Forscher einen minimalen Mittelweg zwischen dieser relativ kontrollierten In-vitro-Methode und dem signifikanten Anstieg der Kosten, Einrichtungen und Zeitanforderungen für die In-vivo-PDX-Nutzung.
Wir haben mehrere In-vitro-Modelle beschrieben, die 3D-Zellkultur innerhalb einer unterstützenden Matrix implementieren, und vor kurzem erweitert, dass arbeite, um die Ex-vivo-Kultur von multiplem Prostatakrebs (PCa)-abgeleiteten PDXs zu demonstrieren, sowohl allein als auch in Co-Kultur mit Knochenmark-abgeleiteten Fibroblasten4,5. Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogelmatrizen bieten anpassbare und biologisch relevante Unterstützung für beide Zelltypen, mit leichter Kontrolle über Hydrogeleigenschaften und optischer Klarheit für die Bildgebung durch die Hydrogeltiefe6.
Reife PDX-Tumorgewebe bestehen aus einer variablen Mischung aus heterogenen menschlichen Krebszellen und Mausstroma (Fibroblasten, Endothelzellen usw.). Um zelltypspezifische Beiträge zur Tumorprogression in vitro zu untersuchen, kann es vorteilhaft sein, Tumore zu dissoziieren, die Zellpopulationen zu trennen und experimentell in organisierter Weise zu integrieren, um Wege der interzellulären Kommunikation zu sezieren. Die gemischten Zellpopulationen in Gewebeverdauungen haben eine Differentialverträglichkeit mit bestimmten Kulturbedingungen. Beispielsweise erfordert die tumorassoziierte Fibroblasten-Lebensfähigkeit entweder die Oberflächenhaftung oder 3D-Matrizen, die mit Integrin-Liganden funktionalisiert sind, während epitheliale abgeleitete PDX-Zellen in der Regel nicht diese Anforderungen haben, sondern Zell-Zell-Wechselwirkungen bevorzugen. Diese Unterschiede können genutzt werden, um eine effektive Trennung von PDX-Zellen von kontaminierenden Mausstromalzellen zu erreichen. Die Rotationskultur von Gewebeverdauten ermöglicht die Anhaftung von Stromalzellen an der Gewebekulturoberfläche, während Zellzellverklebungen PDX-Zellen, die über der rotierenden Kulturoberfläche schweben, dazu bewegen, in 24 bis 48 h mehrzellige Cluster im Überstand zu bilden. Die spezifischen Eigenschaften dieser Cluster variieren mit dem PDX (z. B. große, enge, stark sphärische Cluster oder kleinere, lockerere Aggregate, die Traubentrauben ähneln), sind aber typischerweise biologisch relevant (Durchmesser 50 bis 250 m), ausreichend für die Beurteilung zellulärer Wechselwirkungen, die auf interzellulären Kontakten beruhen.
Tumor-Retrieval und -Verarbeitung führt unweigerlich zu einem gewissen Grad an Kollateralzelltod, entweder aufgrund kurzfristiger Schäden durch mechanische/enzymatische Störungen oder aufgrund langfristiger Inkompatibilität von Subpopulationen mit den gewählten Kulturbedingungen. Trotz der Nützlichkeit der Rotationskultur als anfängliche Massentrennung werden tot- oder sterbende Zellen unweigerlich mit den PDX-Clustern übertragen und können die resultierende Kultur beeinflussen. Bei diesen abgestorbenen Zellen handelt es sich oft um einzelne PDX-Zellen, die nicht in einen Cluster integriert waren, mausstromaler Fibroblasten, die unter ausgewählten Kulturbedingungen nicht überleben können, oder besonders fragile Endothelzellen. Solche sterbenden Zellen können experimentelle Ergebnisse von “Überlebenden” beeinflussen und die Quantifizierung wesentlich beeinflussen, z. B. durch fluoreszierende bildbasierte Durchführbarkeits-Screening-Assays. Um die Auswahl lebender PDX-Zellen aus dieser Methode zu verbessern, haben wir Zentrifugationsmethoden mit Dichteschritten angepasst, um einzelne abgestorbene/sterbende Zellen einfach aus PDX-Mischungen zu entfernen und überwiegend lebende mehrzellige Cluster zu behalten.
Um die Untersuchung von resultierenden PDX-abgeleiteten Clustern in der 3D-Kultur zu verbessern, haben wir eine mikrofluidics-basierte Perfusionskulturplattform verwendet, die OrganoPlate (Abbildung 1), die eine Hochdurchsatz-Organ-on-a-Chip-Plattform ist, die eine gleichzeitige Kultur von bis zu 96 einzelnen perfundierten 3D-Kulturen auf einer 384-well Mikrotiter-Plattenbasis ermöglicht (Abbildung 1A)7,8. In der 2-spurigen mikrofluidischen Platte wird ein einzelner Gewebechip durch zwei mikrofluidische Kanäle(Abbildung 1B, Gelkanal: rot, Perfusionskanal: blau) verbunden, die vier Brunnen hintereinander umfassen. Die beiden mikrofluidischen Kanäle sind durch einen kurzen Kunststoffrücken, den sogenannten Phaseguide, getrennt, der das Überlaufen eines Kanals in den angrenzenden Nachbarkanal verhindert und gleichzeitig eine membranfreie Schnittstelle zwischen dem Inhalt des Gels und dem Perfusionskanal9ermöglicht. Da der Boden der mikrofluidischen Platte aus mikroskopischem Glas besteht, können die Kulturen im Beobachtungsfenster durch den Boden der Platte mit einem Standard- oder automatisierten Mikroskop betrachtet werden. Perfusion wird in der mikrofluidischen Platte mit einer programmierbaren Wippe etabliert, mit Schwerkraft, um Medien durch die mikrofluidischen Kanäle zu treiben, zwischen Reservoirbrunnen (Abbildung 1C). Die Perfusions-Flow-Mimik rekapituliert die Tumormikroumgebung genauer als die statische Kultur, was die Einbeziehung von Scherspannung und eine verbesserte Verteilung von Gasen und Nährstoffen ermöglicht. Die Vorteile der Aufrechterhaltung einer durchbluteten Krebszellkultur in der mikrofluidischen Platte wurden zuvor als durchfundierte Brustkrebskulturen beschrieben, die eine optimale Lebensfähigkeit im Vergleich zu einer statischen 3D-Kultur der gleichen Zellen aufwiesen7.
Der vorliegende Bericht beschreibt eine angepasste Methode zur Zentrifugierung des Dichtegradienten zur Isolierung von lebenden mehrzelligen PDX-Clustern und demonstriert deren Nutzen bei der Etablierung von 3D-PDX-Kulturen innerhalb durchdringender mikrofluidischer Platten. Da immer mehr Forschungslaboratorien nach Methoden suchen, um die Verwendung von PDX zu erleichtern, gehen wir davon aus, dass die hier vorgestellten Protokolle sofort von Nutzen sein werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Verarbeitung und Kultivierung lebensfähiger PDX-abgeleiteter Tumorzellen in einem durchdrungenen 3D-Kultursystem mit hohem Durchsatz. Während dieses Protokoll PCa PDX Gewebe verwendet, Es ist ebenso wirksam für andere epitheliale-abgeleitete Tumoren. Die Tumoreigenschaften variieren zwischen den einzelnen PDX-Linien sogar innerhalb desselben Ursprungsgewebes (Prostata, Brust usw.). Einige PCa PDX-Linien sind eher fibrotisch und schwierig, lebensfähige Zellen zu isolieren, währen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von national Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) und P01CA098912 unterstützt.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
