Summary

הרכבה ואפיון של מטלות מורכבות פוליאלקטרוליט

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

אנו מספקים פרוטוקולים ונתונים מייצגים עבור עיצוב, הרכבה, ואפיון מיקרו מורכבות מורכבים, חלקיקים ליבה פגז שנוצרו על ידי פוליאלקטרוליטים וטעונה הידרופילי מחויב לחסום הסופולימרים.

Abstract

מיקרואלקטרוליטים מורכבים (PCMs), ליבה פגז חלקיקים נוצר על ידי הרכבה עצמית של פולימרים טעונים בתמיסה מימית, לספק פלטפורמה רבת עוצמה לחקור את הפיסיקה של אינטראקציות פוליאלקטרוליט וגם להציע פתרון מבטיח הבעיה הדחופה של העברת הטיפול הרפואי בvivo. פיתוח מבנה חזוי-קשרי גומלין עבור PCMs הוכיחה קשה, בין השאר בשל נוכחותם של מלכודות קינטי חזקים במהלך ננו-חלקיק self-הרכבה. מאמר זה דן בקריטריונים לבחירת פולימרים עבור בניית PCM ומספק פרוטוקולים המבוססים על ריפוי מלחים המאפשרים הרכבה של חלקיקים מתאפשרים לשחזור, בעלי מבנה מצומצם. אנו דנים גם באפיון PCM באמצעות פיזור אור, פיזור של קרני רנטגן קטנים ומיקרוסקופ אלקטרוני.

Introduction

כאשר הפוליאלקטרוליטים טעונים בהחלט מעורבים בתמיסה מימית, הזכות באנטרופיה משחרור היונים הנגדיות שלהם גורמת לביטול הפתרון לשלב צפוף של פולימר ומרוקן-על-פי הפולימר1,2,3,4,5, תופעה הידועה בשם polyelectrolytes complexation. אם בלוק הידרופילי נייטרלי מופיע לאחד או לשני הפוליאלקטרוליטים, הפרדת הפאזה הננו מתרחשת במקום (איור 1א). חלקיקי הליבה-פגז שנוצר כתוצאה מכך מכונים באופן שונה מיקרואלקטרוליט מורכבים (pcms), polyion מורכבים מיקרולים, לחסום את מכלולי מתחמי, או מרכיבי הליבה של מיקרו-ליבה על ידי אנלוגיה כדי למנוע, למרות כל הרכיבים של המערכת הם ידרופילי6,7. היכולת של PCM לכמס מולקולות הידרופיליות כגון חלבונים וחומצות גרעין, כמו גם את היכולות הנרחבות המוצעות על ידי ארכיטקטורת המנשא של בלוק סופולימר הופכת אותם למועמדים אטרקטיביים לאספקת מולקולות טיפוליות ב vivo8,9,10,11,12,13.

אספקת חומצות גרעין טיפולית למטרות סלולריות הוא אתגר חשוב במיוחד, ואחד אשר PCMs להציע מספר יתרונות. חומצות גרעין תרפויטי (דנ א גנטי, mrna, ו פורוזימטר כגון sirna) יש פוטנציאל עצום לשיפור בריאות האדם, אבל חייב להתגבר על חסימות ביולוגיות ופיזיות רבות כדי להבין כי פוטנציאל14,15,16. חומצות גרעין חשופים מושפל על ידי הנסיוב והנוקלאוסים הסלולריים, נמחקים במהירות מהמחזור, ואת המטען השלילי חזק שלהם מקשה עליהם לחדור קרום התא ללא סיוע. גישות נוכחיות להתגברות על המחסומים הללו כוללות שינויים כימיים יקרים כדי למנוע נזק של נוקלאוסים ו/או כימוס לתוך חלקיקי שומנים שונים שנאספו באמצעות אינטראקציות הידרופובי15,17,18. בעוד שיטות אלה הוכיחו יעילות עבור זריקות מקומיות ומיקוד הכבד, שימוש מערכתי מציג מגבלות משמעותיות של רעילות, חיסוני, ומוגבל biodistribution16. לעומת זאת, pcms להשתמש במטען שלילי של חומצות גרעין כדי לדחוס אותם בתוך הליבה מופרדים פאזה, בעוד הקורונה נייטרלי מספק מכשול אפקט סטרי נגד השפלה, כמו גם פלטפורמה לשילוב ליגנדס כדי לשפר את המיקוד או הפנמה11,19. בתחומי החוץ מבחנה ובעלי חיים הוכיחו כי pcms יכול ביעילות לספק מטענים חומצות גרעין שונים20,21,22,23,24, אבל חולשות ביכולתנו לחזות מאפייני PCM כגון גודל, צורה, ויציבות מן המאפיינים של פולימרים המכוננת הפריע האימוץ הרחב שלהם.

העבודה האחרונה על ידי הקבוצה שלנו ואחרים בתחום החלה לטפל בבעיה זו על ידי פיתוח מבנה-נכס, ובמקרים מסוימים מבנה קשרים בפונקציה של pcms נוצר מחומצות גרעין ופולימרים מסוגים שונים הנייטרלי7,25,26,27. שני נושאים עקביים שצצו ממחקרים אלה הם החשיבות של פיתוח היטב מבוקרת, פרוטוקולים לשחזור עבור הרכבה PCM והיתרון של שימוש בטכניקות מרובות כדי לאפיין את חלקיקי התוצאה. פוליאלקטרוליטים, במיוחד אלה עם צפיפות גבוהה כמו חומצות גרעין, אינטראקציה אחד עם השני מאוד חזק, ולהיראות בקלות להיות קיסטי לכוד על ערבוב, וכתוצאה מכך ההכנות PCM כי הם רגישים מאוד וריאציות קטנות בהליך ולהציג ברמה גבוהה polyelectrolytes היכולת לעבור העניים מאצווה כדי אצווה. PCMs הוכחו גם לאמץ מגוון רחב של צורות וגדלים בהתאם תצורות ברמה האטומית של הרכיבים שלהם, ולכידת זה גיוון עם כל טכניקה האפיון הפרט קשה מאוד, במיוחד מאז כמה טכניקות נפוצות כגון פיזור אור דינמי (DLS) דורשים הנחות על צורת חלקיקים עבור הפרשנות שלהם.

במאמר זה, אנו דנים בעיצוב ובבחירה של חומרים עבור PCMs, עם דגש על מחלת האוליונודיליות והסופולימרים מבוססי-בלוק ניטרליים. לאחר מכן נתאר נוהל ריפוי מלחים שעושה שימוש בריכוזים גבוהים של מלח ואחריו באמצעות דיאליזה איטית כדי למנוע השמנה קינטית במהלך הרכבת PCM. הפוליאלקטרוליטים מעורבבים בתנאי מלח גבוהים, שבהם מוקרנים אטרקציות אלקטרוסטטית, אז ריכוז המלח מופחת באיטיות כדי לאפשר לפוליאלקטרוליטים להתיישב בתצורות החיוביות האנרגטית ביותר שלהם, האנלוגית לתהליך הצינון האיטי של ריפוי תרמי. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים בדרך כלל להשיג באופן קבוע מאוד מזידיניות נמוכות והחזרה גבוהה עבור מחלת הסוכר pcms7,26. לבסוף, אנו מתארים כיצד ארבע טכניקות מדידה נפרדות ניתן להשתמש כדי לאפיין PCMs על פני מגוון רחב מאוד של קשקשים אורך, מורפולוגיה חיצונית למבנה פנימי: DLS, רב זווית פיזור אור (דוליטל), זווית קטנה קרני רנטגן (סאקס), ו מיקרוסקופ אלקטרון הילוכים (TEM). אנו מקווים כי פרוטוקולים אלה יאפשרו יותר חוקרים לחקור ביעילות את היכולות של חלקיקים מעניינים אלה.

מבחר פולימר והכנה
מאפייני PCM מושפעים מאוד מהמאפיינים הפיזיים והכימיים של הפולימרים המכוננת, מה שהופך את בחירת הפולימר לצעד קריטי בתהליך העיצוב. הסופולימרים בלוק מאופיין ביותר עבור חומצות גרעין PCMs הם diblocks ליניארי כגון פולי (ליזין)-פולי (אתילן גליקול) (pLys-יתד), אבל PCMs ניתן ליצור בין פוליאלקטרוליטים ומגוון של פולימרים הידרופילי טעון נייטרלי, אשר ניתן לייצר באופן תפוקה גבוהה28. הבחירה של הקבוצה טעונה בחוזקה משפיע על היציבות של שיוך יונים וצורה של מיקרולים26, ו-PCM גודל הוכח להגדיל עם אורך של בלוק טעונה5,7,26 (איור 2), ובכך לאפשר מאפייני PCM להיות מכוון לדרישות של יישום רצוי. עבור diblocks ליניארי, גילינו כי הבלוק טעונה צריך לפחות 10 חיובים להיות טעונה מאוד ב-pH הרצוי. בלוקים טעונים עוד עשוי לקדם את מבנה ה-PCM עם פורוזימטר כגון sirna, אשר קשה מורכבים עם בלוקים קצרים יותר21. הבחנו בהצלחה בהיווצרות PCM עם אורכים לחסום עד 200, והספרות מתארת פולימרים ארוכים יותר. גמישות רבה יותר זמין בבחירה של בלוקים ניטרליים24, אבל הניסיון הראה כי בלוקים ניטרליים קצר מאוד להוביל לצבור ולא ננו-חלקיק היווצרות, וכי אורך מינימלי נייטרלי גדל עם אורך בלוק טעונה. עבור pLys-יתד, מגוואט יתד של לפחות 3000 – 5000 נדרש עבור pLys אורכים מתחת ~ 50, ובאורכים ארוכים נדרשים כמו לחסום טעונה מוגברת יותר. הגדלת אורך בלוק נייטרלי תוצאות בגודל PCM מוגבר, במיוחד עובי פגז, עקב הצפיפות אפקט סטרי של פולימרים ניטרליים.

כתב יד זה מציג פרוטוקול להכנת pcms מן הטוהר הגבוהה העליון plys-יתד ו-פורוזימטר של כמות ידועה, אבל צריך להיות שניתן להתאמה בקלות למערכות אחרות, כמו גם. בדקנו אותו בהצלחה עם polypeptides טעונים מספר, כולל polyarginine ו polyglutamic חומצה, כמו גם מספר רב של פוליאלקטרוליטים סינתטיים, כגון חומצה פוליאקרילית ו פולי (וינילוקסיל trimethymonium). כמו כן, אנו מתארים הכנת PCMs עם יחס stoichiometric של חיובים פוליאלקטרומטרים, אבל זה שונה בקלות. אנו מוצאים את זה הכי קל לעבוד ביחידות ריכוז (סיסי), אשר גם מתאים באופן טבעי פולימרים שאינם טעונים במלואה. אם או פולימר לא מאופיין היטב, יש לנקוט כדי לקבוע במדויק את אורכי/גושים פולימריים ולהבטיח כי מלח עודף אינו נוכח מעבר לזה הדרוש עבור ניטרול החיוב על ידי דיאליזה, למשל. יש להתייחס לנוכחות של מים שנשמרו גם כאשר ריכוזים מחושבים. ריכוז חומצות גרעין ניתן לכמת בנוחות על ידי ספיגת ב260 nm, ואת הנוכחות או העדר פוספטים מסוף צריך להיחשב בעת חישוב הסיסי

כאשר משתמשים ב-olig, מבנה כימי של מדינת הכלאה וכימית, מסייעים לקבוע את הנטייה להרכבה עצמית ולמאפייני ה-PCM המתקבל5,7,26. מיטוב אלה, בתוך הדרישות של יעילות ביולוגית אם באמצעות PCMs למסירה, יגדיל את הסבירות להרכיב את המבנים הרצויים. כלים שימושיים לניתוח היברידיזציה כוללים פונקציות MATLAB עבור חומצות גרעין, NUPACK29, ו IDT OligoAnalyzer. אנו ממליצים לנתח רצף של מועמד כדי להבין את כוחה של הכריכה ל -1) עצמו בצורה של סיכת ראש; 2) עותק נוסף של אותו רצף (self-dimer); ו-3) לעוד מחלת האוגורונודים המצויים במערכת. DNA ו-RNA טמפרטורות התכה עבור רצף מסוים יכול גם להיות מחושב באמצעות שיטת השכנה הקרובה30,31. ריפוי תרמי של חומצות גרעין (שלב 2.3) מודד מבנה משני שיורית בנוקלאוטידים הבודדים ומקדם קיפול שיווי משקל.

אפיון וניתוח PCM
מגוון רחב של טכניקות זמינות לאפיון חלקיקי חלקיקים, כולל פיזור אור סטטי ודינאמי, פיזור זווית קטן של אלקטרונים או נויטרונים, ומיקרוסקופ אלקטרוני. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים עבור שתי טכניקות פיזור אור, זווית קטנה פיזור קרני רנטגן, ושתי טכניקות המיקרוסקופיה אלקטרונים.

DLS מודד את הקורלציה האוטומטית של תנודות הזמן בעוצמת פיזור בזווית אחת מתנועה בראונית של המדגם. התאמת נתונים אלה יכול לספק רדיוס הידרודינמי ופולידיסטיטיות עבור מיקרולים כדוריים (איור 3). פיזור אור זווית מרובה (דוליטל) מודד את עוצמת פיזור סטטי בזוויות רבות. התלות הזוויתית הזאת מתארת את צורת הננו-חלקיק אך מוגבלת לאורך הזמן הארוך יותר מ-~ 50 ננומטר לאור גלוי, המגביל את יעילותו לחלקיקים קטנים יותר. שתי הטכניקות מבוססות על חוסר התאמה במדד השבירה ומתארות בעיקר את הממדים החיצוניים של הננו-חלקיק.

זווית קטנה X-ray פיזור (סאקאס) משתמש קרני רנטגן כמו בדיקה פיזור, ואת אורך הגל הקצר שלהם מאפשר מדידות מעל טווח של ~ 0.1 – 100 ננומטר. מתאים את עוצמת פיזור נצפתה לעומת זווית (ביטוי מקובל כמו מומנטום העברה q) מספק מידע על מורפולוגיה PCM (כלומר, גודל וצורה) וגם מבנה פנימי. אם כיול אינטנסיביות מוחלט זמין, ואם עוצמת הפיזור ניתן להטות לזווית אפס, המסה PCM ואת מספר הצבירה יכול להיות גם מוערך32, מה שהופך את הסאקס לשיטה מגוונת ורבת ערך במיוחד. זווית קטנה של נייטרון (SANS) הוא רגיש על פני מגוון דומה של קשקשים אורך אך זמין רק במתקנים מיוחדים ולא יידונו במפורש במאמר זה33,34,35.

השנים האחרונות ראו את הופעתו של כלים מהשורה העליונה של הספסל, אבל אנחנו מוצאים כי מקורות סינכרוטרון מתאימים יותר עבור האפיון PCM, כמו אינטנסיביות גבוהה יותר שלהם מאפשר נתונים לאסוף הרבה יותר מהר עבור אלה דגימות חדות נמוכה. אנו מספקים פרוטוקול קצר לרכישת נתוני ה-PCM ב-Beamline 12-ID-B במקור פוטון מתקדם (ארגוננה המעבדה הלאומית, ארה ב) מנקודת מבט של משתמש. פרוטוקול זה צריך להיות ישים על רוב המקורות הסינכרוטרון, אבל התייעצות עם צוות מקומי לפני הצעת ניסוי מומלץ מאוד. אנו מספקים גם הפחתת נתונים פרוטוקול ניתוח באמצעות אירנה36, סט חינם של פקודות מאקרו שנכתבו עבור איגור Pro. אירנה כוללת סט רב-תכליתי של מרכיבי טופס למידול נתוני ה-סאקס ומאפשר בנייה של מודלים רב-רכיבים המסוגלים לתאר את פרופיל הפיזור המורכב של PCMs (ראה תוצאות מייצגות, איור 4). אירנה יש גם תיעוד מקיף הדרכות זמין באינטרנט. לפני שמנסים את ההליכים הבאים, אנו ממליצים לכרות עם אלה, במיוחד את ערכת הלימוד “דוגמנות של נתוני ה-סאקאס עם שתי אוכלוסיות מרכזיות”.

פגיעה בקרינה היא דאגה לפיזור קרני רנטגן, אך מספר מדדים יכולים להיות מועסקים כדי למזער אותו. במיוחד, אנו ממליצים להשתמש בכיוונון תא זרימה עם משאבת מזרק ו-PCM מדגם זורם במהלך רכישת נתונים, ולא נימי. זה גם מפשט במידה ניכרת את החיסור הרקע. אנו מציעים גם לקיחת חשיפות מרובות של המדגם זורם במקום אחד עוד אחד כדי להגביל את שטף כי כל נפח יחיד של המדגם רואה וכדי לאפשר השוואה של נתוני החשיפה כדי לזהות כל נזק.

בניגוד לטכניקות פיזור, אשר בדרך כלל דורשים התאמה לפענוח, העברת אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) מספק מרחב אמיתי תמונה חזותית של חלקיקי חלקיקים על ידי העברת קרן אלקטרון דרך המדגם ומקרין תמונה על המסך (איור 5). אנו מציגים פרוטוקולים עבור שתי טכניקות TEM במאמר זה. מיקרו לאחר ההקפאה לתוך שכבה דקה של קרח אינדקטור, שמירה על קונפורמציה מבנית עם חומרים זרים מינימליים, אופטימלי עבור מיקרולים ≤ ~ 10-100 nm ברדיוס. כתם שלילי TEM משתמשת מלח מתכת כבדה (למשל, אורניום) כדי להקיף את המדגם לאחר שהתייבש על פני השטח של רשת. הכתם הצפוף יפזר יותר אלקטרונים מאשר המדגם, הוספת ניגודיות והפקת תמונה שלילית של המדגם. ההקפאה מומלצת לתמונות באיכות גבוהה. עם זאת, הוא יקר יותר, זמן רב, ואינו יכול לספק ניגודיות מספקת. כאשר מדובר בדאגה, יש להשתמש בדגימות שליליות. דוגמאות לכל אחת מהן מוצגות באיור 5.

כל אחת מטכניקות אלה מדווחת על היבטים שונים מעט של חלקיקים, עם חוזק ומגבלות שונות. פיזור אור זמין, והוא לעתים קרובות הגישה המהירה ביותר, אבל יש מגבלות משמעותיות ברזולוציה גודל וצורה. ה-סאקאס יכול לספק מידע על מגוון רחב של קשקשים באורך בתפוקה גבוהה באופן סביר, אך דורש ציוד מיוחד כדי לרכוש את הנתונים, כמו גם מידול כדי לפרש אותו. תמונות TEM הם פשוט לפרש אבל יכול להיות מוגבל בניגוד והם תפוקה נמוכה מטבעו. הניסיון שלנו הראה כי שימוש בטכניקות מרובות לאפיון מגדיל מאוד את המידע שניתן להשיג על מאפייני PCM ומפשט את הפרשנות של ערכות נתונים שהתקבלו מכל אחד בלבד. לדוגמה, ה-סאקאס ו-TEM בעיקר בודקים ליבה צפופה של PCM, בעוד שפיזור האור מדווח על הממדים הכלליים של הננו-חלקיק. לכן, שילוב שלהם מאפשר מדידה של שני הליבה וגודל קורונה. היכולת של TEM לרכוש תמונות מרחב אמיתי יכולה לספק נתוני אמת קרקעיים כדי לאפשר בחירה של גורמי טופס מתאימים למידול נתוני ה-סאקס שעלולים להיות ברורים יותר. מאמר זה מתאר פרוטוקולים עבור כל ארבע הטכניקות, ותהליך לדוגמה לשימוש בהם כדי לאפיין מדגם לא ידוע מוענק במקטע הדיון .

Protocol

1. הכנת חומרים לשקול החוצה מפולימר diblock ולהוסיף מים עד כמעט נפח הנדרש עבור פתרון מניות של 10 מ”ג/mL ריכוז סופי. מערבולת במהירות מקסימלית עבור 2 דקות. Sonicate עבור 5 דקות. מאוד הרבה diblocks עשויים לדרוש sonication נוספים. פתרון המניה אמור להופיע שקוף ואחיד לחלוטין. התאם את ה-pH ל 7.4 באמצעות NaOH א…

Representative Results

על מנת להמחיש את שיטות האפיון המתוארות לעיל, אנו מראים תוצאות טיפוסיות עבור pcms התאספו מ פורוזימטר ולחסום סופולימרים באורכים שונים וchemistries (איור 1). איור 2 מספק דוגמה לגודל הליבה PCM (כפי שנקבע מ-סאקאס ו-TEM, איור 4 ואיור 5) מגוון עם ?…

Discussion

כפי שהוזכר לעיל, הפרוטוקולים המוצגים כאן נכתבים עם דגש על פורוזימטר כמו מרכיב polyanion ו plys-יתד כמו בלוק נייטרלי מחוסמת, אבל בדקנו אותם עם מגוון רחב של פולימרים, כגון פולי (חומצה אקרילית), polyגלוטמט, ו יתד-פולי (vinylבנזיל trimethממוניום), ולהאמין שהם יהיו ישימים בדרך כלל עבור רוב הצמדים הפוליפונים. פר?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים פיל גריפין ו Tera Lavoie של מתקן האפיון של החומר הרך ומתקן המיקרוסקופיה אלקטרון מתקדם, בהתאמה, באוניברסיטת שיקגו. כמו כן, אנו מודים לאוקובאינג זואו ולסואנקה סייפרט של מקור הפוטון המתקדם במרכז המעבדה הלאומית של ארגוננה ומרכז נשים לעיצוב חומרים הירארכיים (CHiMaD) לקבלת תמיכה. אנו מודים לג טינג ולמייקל. לואקלי על תרומתם לעבודה זו

Materials

70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System – a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin – a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. . Materials Data Facility. , (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Play Video

Cite This Article
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

View Video