Samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmiceller

Summary

Vi leverer protokoller og repræsentative data til design, samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmicelles, nanopartikler af kerneskallen dannet af polyelektrolytter og hydrofile ladede blok-copolymerer.

Abstract

Polyelektrolyt kompleks micelles (PCMs), core-shell nanopartikler dannet af selvsamling af ladede polymerer i vandig løsning, giver en kraftfuld platform til at udforske fysik polyelektrolyt interaktioner og tilbyder også en lovende løsning på det presserende problem med at levere terapeutiske oligonucleotider in vivo. Udvikling af prædiktive struktur-ejendom relationer for PCMs har vist sig vanskeligt, til dels på grund af tilstedeværelsen af stærke kinetiske fælder under nanopartikel selvsamling. Denne artikel diskuterer kriterier for valg af polymerer til PCM konstruktion og giver protokoller baseret på salt annealing, der gør det muligt samling af repeterbare, lav polydispersity nanopartikler. Vi diskuterer også PCM karakterisering ved hjælp af lys spredning, lille vinkel X-ray spredning, og elektron mikroskopi.

Introduction

Når modsat ladede polyelektrolytter blandes i vandig opløsning, entropi gevinst fra frigivelse af deres modtællere forårsager demixing af opløsningen i en polymer-rige kondenseret fase og en polymer-forarmet supernatant^1,2,3,4,5, et fænomen kendt som polyelektrolyt kompleksation. Hvis en neutral hydrofile blok konjugeres til den ene eller begge polyelektrolytter, sker nanoskalafaseadskillelsen i stedet (figur 1A). De resulterende selvsamlede kerneskal nanopartikler er skiftevis benævnt polyelektrolyt komplekse micelles (PCMs), polyion kompleks micelles, blok ionomkomplekser, eller coacervate-core micelles analogt til overfladeaktive micellization, selv om alle komponenter i systemet er hydrofile^6,7. En PCM evne til at indkapsle hydrofile molekyler såsom proteiner og nukleinsyrer, samt den omfattende tunabilitet, der tilbydes af blokken copolymer luftfartsselskab arkitektur gør dem attraktive kandidater til at levere terapeutiske molekyler i vivo^{8,9,10,11,12,13}.

Levering af terapeutiske kerner syrer til cellulære mål er en særlig vigtig udfordring, og en, som PCMs tilbyder flere fordele. Terapeutiske nukleinsyrer (genetisk DNA, mRNA, og oligonucleotider såsom siRNA) har et enormt potentiale for at forbedre menneskers sundhed, men skal overvinde mange biologiske og fysiske barrierer for at indse, at potentielle^14,15,16. Nøgne nukleinsyrer nedbrydes af serum og cellulære nukleases, er hurtigt ryddet fra cirkulation, og deres stærke negative ladning gør det vanskeligt for dem at trænge ind cellemembraner uden hjælp. De nuværende metoder til at overvinde disse barrierer omfatter dyre kemiske ændringer for at forhindre skader fra nukleases og/eller indkapsling i forskellige lipidnanopartikler samlet via hydrofobe interaktioner^15,17,18. Mens disse metoder har vist sig effektive til lokale injektioner og levermålretning, giver systemisk brug betydelige begrænsninger af toksicitet, immunogenicitet og begrænset biodistribution^16. I modsætning hertil bruger PCM’er den negative ladning af nukleinsyrer til at kondensere dem inden for den faseseparerede kerne, mens den neutrale korona giver en steric barriere mod nedbrydning samt en platform til at indarbejde ligander for at forbedre målretning eller internalisering^11,19. In vitro og dyreforsøg har vist, at PCM’er effektivt kan levere forskellige nukleinsyre nyttelast^{20,21,22,23,24}, men svagheder i vores evne til at forudsige PCM egenskaber såsom størrelse, form, og stabilitet fra egenskaberne af de konstituerende polymerer har hindret deres bredere vedtagelse.

Det seneste arbejde fra vores gruppe og andre på området er begyndt at løse dette problem ved at udvikle struktur-ejendom, og i nogle tilfælde struktur-ejendom-funktion relationer for PCM’er dannet af nukleinsyrer og forskellige kationiske-neutrale polymerer^7,25,26,27. To konsekvente temaer, der er opstået fra disse undersøgelser er vigtigheden af at udvikle velkontrollerede, repeterbare protokoller for PCM samling og fordelen ved at bruge flere teknikker til at karakterisere de resulterende nanopartikler. Polyelektrolytter, især dem med høj ladning tæthed som nukleinsyrer, interagere med hinanden meget stærkt, og synes at let blive kinetisk fanget ved blanding, hvilket resulterer i PCM præparater, der er meget følsomme over for små variationer i proceduren og vise høj polydispersitet og dårlig repeterbarhed fra batch til parti. PcMs har også vist sig at vedtage en bred vifte af former og størrelser afhængigt af atomniveau konfigurationer af deres komponenter, og fange denne mangfoldighed med enhver individuel karakterisering teknik er meget vanskeligt, især da nogle almindelige teknikker såsom dynamisk lys spredning (DLS) kræver antagelser om partikelform for deres fortolkning.

I denne artikel diskuterer vi materialedesign og -udvælgelse til pc’er med fokus på oligonucleotider og kationiske-neutrale diblock-copolymerer. Vi beskriver derefter en saltglødningsprotokol, der bruger høje saltkoncentrationer efterfulgt af langsom dialyse for at undgå kinetisk fældefangst under PCM-samling. Polyelektrolytterne blandes i høje saltforhold, hvor elektrostatiske attraktioner screenes, og saltkoncentrationen sænkes langsomt, så polyelektrolytterne kan falde til ro i deres mest energisk gunstige konfigurationer, svarende til den langsomme afkølingsproces med termisk glødning. Ved hjælp af denne protokol, vi er regelmæssigt i stand til at opnå usædvanlig lav polydispersity og høj repeterbarhed for oligonucleotid PCMs^7,26. Endelig beskriver vi, hvordan fire separate måleteknikker kan bruges til at karakterisere PCMs over en meget bred vifte af længdeskalaer, fra ekstern morfologi til intern struktur: DLS, multi-vinkel lys spredning (MALS), lille vinkel X-ray spredning (SAXS), og transmission elektron mikroskopi (TEM). Vi håber, at disse protokoller vil gøre det muligt for flere forskere effektivt at udforske mulighederne for disse interessante nanopartikler.

Polymer udvælgelse og forberedelse
PCM egenskaber er stærkt påvirket af de fysiske og kemiske egenskaber af de konstituerende polymerer, hvilket gør polymer udvælgelse et kritisk skridt i designprocessen. De mest velkarakteriserede blokcopolymerer til nukleinsyre-PC’er er lineære diblocks såsom poly(lysin)-poly (ethylenglycol) (pLys-PEG), men PCM’er kan dannes mellem polyelektrolytter og en række hydrofile neutralladede polymerer, som kan genereres på en høj gennemløbsmåde²⁸. Valget af ladede gruppe påvirker i høj grad stabiliteten af ionparring og form af micelles²⁶, og PCM størrelse har vist sig at stige med længden af den ladede blok^5,7,26 ( Figur2), således PCM egenskaber, der skal indstilles til kravene i en ønsket anvendelse. For lineære diblocks, har vi konstateret, at den opkrævede blok skal have mindst 10 afgifter og være stærkt opkrævet på den ønskede pH. Længere ladede blokke kan fremme PCM dannelse med oligonucleotider såsom siRNA, som er vanskelige at komplekse med kortere blokke²¹. Vi har med succes observeret PCM dannelse med blok længder op til 200, og litteraturen beskriver længere polymerer. Der er større fleksibilitet i valget af neutrale blok²⁴, men erfaringen har vist, at meget korte neutrale blokke fører til aggregering i stedet for nanopartikeldannelse, og at den minimale neutrale længde stiger med ladet bloklængde. For pLys-PEG kræves der en PEG MW på mindst 3.000-5.000 for pLys-længder under ~50, og der kræves længere længder, da den ladede blok øges yderligere. Øget neutral bloklængde resulterer i øget PCM-størrelse, især shelltykkelse, på grund af steric fortrængning af de neutrale polymerer.

Dette manuskript præsenterer en protokol til forberedelse af pcms fra lyophilized høj renhed pLys-PEG og oligonucleotider af kendt mængde, men bør være let kan tilpasses til andre systemer så godt. Vi har testet det med succes med flere ladede polypeptider, herunder polyarginin og polyglutamic syre, samt flere syntetiske polyelektrolytter, såsom polyakrylsyre og poly (vinylbenzyl trimethylammonium). Vi beskriver også forberedelse af pcms med et stoichiometric forhold af polyelektrolytafgifter, men dette kan nemt ændres. Vi finder det lettest at arbejde med at opkræve koncentrationsenheder (c.c.), som også naturligt rummer polymerer, der ikke er fuldt opladet. Hvis en af polymeren ikke er velkarakteriseret, skal man være omhyggelig med præcist at bestemme polymerlængderne/masserne og sikre, at overskydende salt ikke er til stede ud over det, der er nødvendigt for f.eks. Tilstedeværelsen af eventuelt tilbageholdt vand bør også tages i betragtning, når koncentrationerne beregnes. Nukleinsyrekoncentrationen kan kvantificeres bekvemt ved absorbans ved 260 nm, og tilstedeværelsen eller fraværet af terminalfosfater bør overvejes ved beregning af c.c.

Ved brug af oligonucleotider som polyanioner hjælper hybridiseringstilstanden og den kemiske struktur med at bestemme tilbøjeligheden til selvmontering og egenskaberne ved den resulterende PCM^5,7,26. Optimering af disse, inden for kravene til biologisk effekt, hvis du bruger PCMs til levering, vil øge sandsynligheden for at danne de ønskede strukturer. Nyttige værktøjer til analyse af hybridisering omfatter MATLAB funktioner til nukleinsyrer, NUPACK²⁹og IDT OligoAnalyzer. Vi anbefaler at analysere en kandidat sekvens for at forstå styrken af binding til 1) sig selv i en hårnål dannelse; 2) en anden kopi af den samme sekvens (selv-dimer); og 3) til andre oligonucleotider, der findes i systemet. DNA og RNA smeltetemperaturer for en bestemt sekvens kan også beregnes ved hjælp af nærmeste nabo metode^30,31. Termisk glødning af nukleinsyrer (trin 2.3) denatures enhver resterende sekundær struktur i de enkelte nukleotider og fremmer ligevægt foldning.

PCM-tegnning og -analyse
En bred vifte af teknikker er tilgængelige til at karakterisere nanopartikler, herunder statisk og dynamisk lys spredning, lille vinkel spredning af elektroner eller neutroner, og elektron mikroskopi. I denne artikel leverer vi protokoller for to lysspredningsteknikker, lille vinkel røntgenspredning og to elektronmikroskopiteknikker.

DLS måler autokorrelation en tidsmæssige udsving i spredning intensitet i én vinkel fra Brownian bevægelse af prøven. Montering af disse data kan give hydrodynamisk radius og polydispersitet til sfæriske micelles (figur 3). Multivinkellysspredning (MALS) måler den statiske spredningsintensitet i mange vinkler. Denne vinkelafhængighed beskriver nanopartiklens form, men er begrænset til længdeskalaer længere end ~50 nm for synligt lys, hvilket begrænser dens effektivitet for mindre nanopartikler. Begge teknikker er baseret på brydningsindeks mismatch og primært beskrive de udvendige dimensioner af nanopartikel.

Lille vinkel X-ray spredning (SAXS) bruger røntgenstråler som spredning sonde, og deres kortere bølgelængde tillader målinger over en række ~ 0,1-100 nm. Montering af den observerede spredningsintensitet vs. vinkel (konventionelt udtrykt som momentumoverførsel q)giver oplysninger om PCM morfologi (dvs. størrelse og form) og også intern struktur. Hvis en absolut intensitet kalibrering er tilgængelig, og hvis spredning intensitet kan ekstrapoleres til nul vinkel, PCM masse og sammenlægning nummer kan også anslås^32,hvilket gør SAXS en yderst alsidig og værdifuld metode. Neutronspredning af små vinkler (SANS) er følsom over for en tilsvarende længdeskala, men er kun tilgængelig på specialiserede faciliteter og vil ikke udtrykkeligt blive drøftet i denne artikel^33,34,35.

De seneste år har set fremkomsten af benchtop SAXS instrumenter, men vi finder, at synchrotron kilder er bedre egnet til PCM karakterisering, som deres højere intensitet gør det muligt data, der skal indsamles meget hurtigere for disse lav kontrast prøver. Vi leverer en kort protokol til at erhverve PCM SAXS data på Beamline 12-ID-B på Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) fra et brugerperspektiv. Denne protokol bør gælde for de fleste synkrotronkilder, men det anbefales stærkt at rådføre sig med lokalt personale, før der foreslås et eksperiment. Vi leverer også en datareduktions- og analyseprotokol ved hjælp af Irena³⁶, et gratis sæt makroer skrevet til Igor Pro. Irena indeholder et alsidigt sæt af formfaktorer til modellering af SAXS-data og giver mulighed for konstruktion af multikomponentmodeller, der er i stand til at beskrive pcms’ komplekse spredningsprofil (se repræsentative resultater, figur 4). Irena har også omfattende dokumentation og tutorials til rådighed online. Før du forsøger nedenstående procedurer, anbefaler vi kendskab til disse, især tutorial “Modellering af SAXS data med to vigtigste scatterer populationer”.

Strålingsskader er en bekymring for røntgenspredning, men flere foranstaltninger kan anvendes til at minimere det. Vi anbefaler især at bruge en flowcelleopsætning med en sprøjtepumpe og PCM-prøve, der flyder under dataindsamling, i stedet for en forseglet kapillær. Dette forenkler også i høj grad baggrunden subtraktion. Vi foreslår også, at der tages flere eksponeringer af den flydende prøve i stedet for en længere for at begrænse den strøm, som en enkelt mængde prøve ser, og for at gøre det muligt at sammenligne eksponeringsdataene for at identificere eventuelle skader.

I modsætning til spredningsteknikkerne, som generelt kræver tilpasning til fortolkningen, giver transmissionselektronmikroskopi (TEM) et reelt visuelt rumbillede af nanopartiklerne ved at passere en elektronstråle gennem prøven og projicere et billede på en scintillationsskærm (figur 5). Vi præsenterer protokoller for to TEM teknikker i denne artikel. Cryo TEM fryser micelle prøver i et tyndt lag glaslegemeis, der bevarer strukturel kropsbygning med minimale fremmede stoffer, optimal for micelles ≤~10-100 nm i radius. Negativ plet TEM bruger et heavy metal salt (f.eks uran) til at omgive prøven, efter at den er blevet tørret på overfladen af et gitter. Den tætte plet vil sprede flere elektroner end prøven, tilføjer kontrast og producerer et negativt billede af prøven. Cryo TEM anbefales til billeder i høj kvalitet. Men det er dyrere, tidskrævende, og kan ikke give tilstrækkelig kontrast. Når dette giver anledning til bekymring, bør der anvendes negative farvede prøver. Eksempler på hver findes i figur 5.

Hver af disse teknikker rapporterer om lidt forskellige aspekter af nanopartikler, med forskellige styrker og begrænsninger. Lysspredning er let tilgængelig, og er ofte den hurtigste tilgang, men har betydelige begrænsninger i størrelse og form opløsning. SAXS kan give oplysninger over en lang række længdeskalaer ved rimelig høj gennemløb, men kræver specialiseret udstyr til at erhverve data, samt modellering til at fortolke det. TEM billeder er ligetil at fortolke, men kan begrænses i modsætning og er i sagens natur lav gennemløb. Vores erfaring har vist, at ved hjælp af flere teknikker til karakterisering i høj grad øger de oplysninger, der kan opnås om PCM egenskaber og forenkler fortolkningen af datasæt opnået fra hver enkelt alene. F.eks. undersøger SAXS og TEM primært en PCM’s tætte kerne, mens lysspredningsrapporter om nanopartiklens overordnede dimensioner. Således kombinere dem giver mulighed for måling af både kerne og korona størrelse. TEM’s evne til at erhverve virkelige rumbilleder kan give data om jorden til at gøre det muligt at vælge passende formfaktorer til modellering af SAXS-data, som ellers ville være tvetydige. I denne artikel beskrives protokoller for alle fire teknikker, og der gives et eksempel på brug af dem til at karakterisere et ukendt eksempel i diskussionsafsnittet.

Protocol

1. Fremstilling af materialer Afveje lyophilized diblock polymer og tilsæt vand op til næsten den mængde, der kræves for en bestand opløsning på 10 mg/ml endelig koncentration. Vortex ved maksimal hastighed i 2 min. Sonicate i 5 min. Meget lange diblocks kan kræve yderligere sonikering. Bestanden opløsning bør synes helt gennemsigtig og homogen. Juster pH til 7,4 ved hjælp af NaOH eller HCl efter behov. Tilsæt vand til det endelige volumen. pLys-PEG-opløsninger er ret stabile, me…

Representative Results

For at illustrere de ovenfor beskrevne karakteriseringsmetoder viser vi typiske resultater for PCM’er, der er samlet fra oligonucleotider og blokere copolymerer af forskellig længde og kemi (figur 1). Figur 2 giver et eksempel på, hvordan PCM-kernestørrelse (som bestemt fra SAXS og TEM, figur 4 og figur 5) varierede med ladet bloklængde. Figur 3 viser DLS-data og tilpas…

Discussion

Som nævnt ovenfor, protokollerne præsenteres her er skrevet med fokus på oligonucleotider som polyanion komponent og pLys-PEG som kationisk-neutral blok copolymer, men vi har testet dem med en række polymerer, såsom poly (akrylsyre), polyglutamat, og PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), og mener, at de vil være generelt gældende for de fleste polyelektrolyt par. En parameter, der kan være nødvendigt at optimere, er saltkoncentrationen, der anvendes til glødning, fordi det skal være højt nok til, at PCM’e…

Materials

70 mm circle filter paper	Whatman	1001-070	Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid	Electron Microscopy Sciences	CF200-Cu	TEM grid
DAWN	Wyatt Technology	DAWN	MALS instrument
DNA oligonucleotide	Integrated DNA Nanotechnologies Inc		Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid	Electron Microscopy Sciences	LC200-Cu	TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50	Alamanda Polymers Inc	mPEG5K-b-PLKC50	Example block copolymer
Milli-Q	Millipore Sigma		Ultrapure water
NanoDrop	Thermo Scientific		For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers	Dumont	N7	Tweezers for grid preparation
Parafilm "M"	Bemis Company Inc	PM996	Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid	Electron Microscopy Sciences	Q210CR1.3	TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System	Brookhaven Instruments	BI-200SM	DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL	Thermo Scientific Pierce Protein Biology	87723	Dialysis cartridge
small volume cuvette	Brookhaven Instruments	BI-SVC	Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System	Gatan	Solarus 950	Plasma system for TEM grids
Talos TEM	FEI	Talos	TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM	FEI	Spirit	TEM used for dry samples
Uranyl Formate	SPI-Chem	16984-59-1	For negative staining samples for TEM
Vitrobot	FEI	Vitrobot	Vitrification robot for cryo grid preparation