动物气味信号的采样和分析
Summary
我们已开发出一种有效的气味信号采样和分析方法，以便了解气味信号在动物通信中如何使用。特别是，我们使用头部空间固体相微缩结合气相谱-质谱法来分析动物气味和气味标记的挥发性成分。
Abstract
我们开发了一种有效的气味信号采样和分析方法，方法是利用头部空间固体相微缩法和气相-质谱法，了解它们如何用于动物通信。该技术允许对气味分泌物的挥发性成分进行半定量分析，从而能够分离和初步识别样品中的成分，然后分析峰值区域比率，以寻找可能表示可能参与信号的化合物的趋势。此当前方法的主要优点是可分析的样本类型范围：缺乏对任何复杂的样品准备或提取的需要;分离和分析混合物成分的能力;检测到的组件的标识;以及提供所检测组件的半定量和潜在定量信息的能力。方法的主要限制与样品本身有关。由于特定兴趣的组件是不稳定的，而且这些成分很容易丢失，或者其浓度发生变化，因此样品在收集后必须妥善储存和运输。这也意味着样品储存和运输条件相对昂贵。这种方法可以应用于各种样品（包括尿液、粪便、头发和香气味分泌物）。这些气味由复杂的混合物组成，在一系列基质中发生，因此需要使用技术来分离单个成分并提取生物兴趣的化合物。
Introduction
对于支撑动物嗅觉信号的化学变化知之甚少，也因为记录和量化气味2挥发性化学特征的方法学挑战。在与高度复杂的化学矩阵合作时，存在几个潜在的陷阱：其中包括在采样和分析气味样本时3。
在伍尔弗汉普顿大学的罗莎琳德富兰克林科学中心，我们正在对气味和气味标记进行分析，以了解它们如何被动物使用。我们把半化学与行为生态学、内分泌学和细胞学结合起来，以增进我们对嗅觉信号在动物传播中所起的作用的理解。
我们开发了一种方法，然后分析了来自各种物种的气味和标记，包括一些非人类灵长类动物（即加冕狐猴、红斑狐猴、日本猴、橄榄大猩猩、黑猩猩）和其他哺乳动物（即猫、牛）。我们收集并分析了各种样本，包括尿液、粪便、头发和香气味分泌物。这些气味和气味标记由化合物的复杂混合物组成，因此用于分析的任何方法都需要包括某种形式的分离技术。如前所述，它们也发生在一系列矩阵中，需要使用技术来提取感兴趣的组件。
Vaglio等人的 先前研究和其他作者5 使用气相色谱-质谱仪（GC-MS）的动态头部空间提取（DHS），同时直接溶剂提取6 和复杂溶剂提取7 也被使用。特别是，动态头部空间采样涉及用已知的惰性气体清除头部空间，最终去除所有挥发性化合物，但那些对样品基质有强烈亲和力的化合物（例如，水样中的极性化合物）除外。
在目前的方法中，我们采用了头空间固体相微缩（HS-SPME）与GC-MS相结合的技术。特别是，我们已经开发和改进了Vaglio等人在以前的GC-MS实验室8、9、10中已经使用的方法。
无溶剂萃取技术非常有效，用于分析小的、高挥发性的化合物（否则很容易从样品中丢失），因为这些方法使化合物在稳定、坚实的相位支撑下无法移动。HS-SPME 使用涂有溶剂聚合物的纤维捕获样品头部空间中的挥发性化合物，或通过浸入水性生物液11提取溶解化合物。聚合物涂层不会对化合物有很强的结合，因此，通过在GC的注入端口加热，可以去除这些化合物。这种方法比溶剂提取技术更强大，也比DHS更有效。
在当前方法中，样品包含在玻璃瓶中。这些小瓶加热到40°C的温度，以模拟动物体温，以促进气味标记的挥发性成分占据小瓶的头部空间。一种SPME纤维，涂有65微米的多晶硅氧烷/二苯二苯（PDMS/DVB）吸收材料，暴露在头部空间环境中，样品中的挥发性成分被吸收到纤维上。在 GC-MS 的入口端口加热纤维时，挥发性部件从纤维中去除，然后由 GC 分离。使用 MS 获取每个组件的质量光谱碎片模式。通过将这些质谱与质量光谱数据库进行比较，可以初步确定气味标记的成分。通过使用自动取样器，我们能够以一致的方式分批分析多个样本。
鉴于每种SPME纤维与极地化学物质具有不同的亲和力，通常根据目标化合物的极性和/或分子量选择纤维。此外，GC 条件会根据 GC 列的类型和目标化合物的特性而改变。
该技术允许对气味标记的挥发性成分进行半定量分析，从而能够分离和初步识别样品中的成分，然后分析峰值区域比率，以寻找可能表示可能涉及信号的气味标记组件的趋势。
目前这种方法的主要优点是：
- 可分析的样本类型范围。
- 无需复杂的样品制备或提取。
- 分析挥发性组件的能力。
- 分离混合物成分的能力。
- 能够识别检测到的组件。
- 能够提供半定量和潜在定量的检测组件信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用控制样品，包括采集样品时产生的环境控制和系统空白，对于解释气味标记样品至关重要。由于采样环境或仪器系统造成的任何峰值都需要排除在气味标记样本之外，以便在任何解释中只包括感兴趣的峰值。这些控制还可以在评估和监测仪器的”健康”方面发挥作用。
该协议包括在每次提取前后对纤维进行条件调节的步骤。使用自动取样器可以简化这一点，并确保样品与样…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢基思·控股协助罗莎琳德·富兰克林科学中心、伍尔弗汉普顿和本·曼特尔制作视频。我们还感谢格洛里亚诺·莫内蒂教授、朱塞佩·皮耶拉奇尼博士和佛罗伦萨大学质谱中心的成员，以及佛罗伦萨CNR ARCA实验室的卢卡·卡拉迈教授和马可·米切洛齐博士帮助建立这种方法。包括手稿中描述的采样和分析方法在内的研究项目得到了两个玛丽·斯考多斯卡-居里欧洲内部研究金（格兰特协议 ID：327083，703611）、来自英国灵长类学会的小额赠款（”感官丰富灵长类动物“）和一笔小型研究补助金（”狩猎采集者有特别的嗅觉吗？‘）从英国学院/勒弗胡尔姆信托到S.V.建立这种方法所需的实验室工作也得到了科学和工程学院年度资助竞赛（伍尔弗汉普顿）到S.V.的资金。
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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