Probenahme und Analyse von Tierischen Duftsignalen
Summary
Wir haben eine effektive Methodik für die Probenahme und Analyse von Geruchssignalen entwickelt, um zu verstehen, wie sie in der Tierkommunikation verwendet werden können. Insbesondere verwenden wir Headspace-Festphasen-Mikroextraktion in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie, um die flüchtigen Bestandteile von Tiergerüchen und Geruchsmarkierungen zu analysieren.
Abstract
Wir haben eine effektive Methodik für die Probenahme und Analyse von Geruchssignalen entwickelt, indem wir Headspace-Festphasen-Mikroextraktion in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie verwenden, um zu verstehen, wie sie in der Tierkommunikation verwendet werden können. Diese Technik ermöglicht die semi-quantitative Analyse der flüchtigen Bestandteile von Geruchssekreten, indem sie die Trennung und vorläufige Identifizierung der Komponenten in der Probe ermöglicht, gefolgt von der Analyse von Spitzenflächenverhältnissen, um nach Trends zu suchen, die Verbindungen bedeuten könnten, die an der Signalisierung beteiligt sein könnten. Die wichtigsten Stärken dieses aktuellen Ansatzes sind die Bandbreite der probentypen, die analysiert werden können; das Fehlen eines Bedarfs an komplexer Probenvorbereitung oder -extraktion; die Fähigkeit, die Bestandteile einer Mischung zu trennen und zu analysieren; die Identifizierung der erkannten Komponenten; und die Fähigkeit, semi-quantitative und potenziell quantitative Informationen über die erkannten Komponenten bereitzustellen. Die Haupteinschränkung der Methodik bezieht sich auf die Stichproben selbst. Da die Komponenten von spezifischem Interesse flüchtig sind und diese leicht verloren gehen oder ihre Konzentrationen verändert werden können, ist es wichtig, dass die Proben nach ihrer Entnahme angemessen gelagert und transportiert werden. Dies bedeutet auch, dass die Lagerungs- und Transportbedingungen der Proben relativ kostspielig sind. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Proben angewendet werden (einschließlich Urin, Kot, Haar- und Geruchssekreten). Diese Gerüche bestehen aus komplexen Mischungen, die in einer Reihe von Matrizen vorkommen, und erfordern daher den Einsatz von Techniken, um die einzelnen Komponenten zu trennen und die Verbindungen von biologischem Interesse zu extrahieren.
Introduction
Über die chemischen Veränderungen, die den olfaktorischen Signalen bei Tieren zugrunde liegen, ist sehr wenig bekannt1,auch wegen methodischer Herausforderungen bei der Erfassung und Quantifizierung flüchtiger chemischer Geruchsprofile2. Bei der Arbeit mit hochkomplexen, chemischen Matrizen gibt es mehrere mögliche Fallstricke; Dazu gehören bei der Probenahme und Analyse der Geruchsproben3.
Am Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, führen wir die Analyse von Gerüchen und Duftmarken durch, um zu verstehen, wie sie von Tieren verwendet werden können. Wir kombinieren Semiochemie mit Verhaltensökologie, Endokrinologie und Zytologie, um die Rolle von olfaktorischen Signalen in der Tierkommunikation besser zu verstehen.
Wir haben eine Methodik entwickelt und dann Gerüche und Markierungen von einer Vielzahl von Arten analysiert, darunter mehrere nichtmenschliche Primaten (z. B. Kronenmakis, Rotrüschenmakis, japanische Makaken, Olivenpaviane, Schimpansen) und andere Säugetiere (dh Katzen, Kühe). Wir haben eine Vielzahl von Proben gesammelt und analysiert, darunter Urin, Kot, Haare und Geruchssekrete. Diese Gerüche und Duftmarken bestehen aus komplexen Mischungen von Verbindungen, und daher muss jede Methodik, die für ihre Analyse verwendet wird, eine Form von Trenntechnik enthalten. Wie dargestellt, kommen sie auch in einer Reihe von Matrizen vor, die den Einsatz von Techniken zur Extraktion der interessierenden Komponenten erfordern.
Frühere Studien von Vaglio et al.4 und anderen Autoren5 verwendeten die dynamische Headspace-Extraktion (DHS) mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), während die direkte Lösungsmittelextraktion6 und komplexe Lösungsmittelextraktionen7 ebenfalls verwendet wurden. Insbesondere beinhaltet die dynamische Headspace-Probenahme das Spülen des Headspace mit einem bekannten Volumen an Inertgas, das letztendlich alle flüchtigen Verbindungen entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die eine starke Affinität zur Probenmatrix aufweisen (z. B. polare Verbindungen in bässrigen Proben).
Für die aktuelle Methodik haben wir die Technik der Headspace-Festphasen-Mikroextraktion (HS-SPME) in Verbindung mit GC-MS übernommen. Insbesondere haben wir die Methodik entwickelt und verbessert, die Vaglio et al. bereits in ihrem vorherigen GC-MS-Labor8,9,10verwendet haben.
Lösemittellose Extraktionstechniken sind sehr effektiv für die Analyse kleiner, leicht flüchtiger Verbindungen (die sonst leicht aus einer Probe verloren gehen können), da diese Methoden Verbindungen auf einem stabilen, festen Phasenträger immobilisieren. Das HS-SPME verwendet eine mit einem Adsorbenspolymer beschichtete Faser, um flüchtige Verbindungen im Probenkopfraum einzufangen oder gelöste Verbindungen durch Eintauchen in eine wässrige biologische Flüssigkeit zu extrahieren11. Die Polymerbeschichtung bindet die Verbindungen nicht stark, daher können sie durch Erhitzen im Einspritzanschluss des GC entfernt werden. Diese Methode ist leistungsfähiger als Lösungsmittelextraktionstechniken und auch effektiver als DHS.
Im aktuellen Ansatz sind Proben in Glasfläschchen enthalten. Diese Fläschchen werden auf eine Temperatur von 40 °C erwärmt, um die Körpertemperatur des Tieres zu simulieren, um die flüchtigen Bestandteile der Duftmarke zu fördern, um den Kopfraum der Durchstechflasche einnahm. Eine SPME-Faser, die mit 65 μm Polydimethylsiloxan/Divinylbenzol (PDMS/DVB)-Sorptionsmittel beschichtet ist, wird der Headspace-Umgebung ausgesetzt und flüchtige Komponenten aus der Probe werden an die Faser adsorbiert. Beim Erhitzen der Faser im Einlass eines GC-MS werden die flüchtigen Komponenten von der Faser dezentriert und dann durch den GC getrennt. Massenspektrale Fragmentierungsmuster werden für jede Komponente mit hilfe der MS erhalten. Durch den Vergleich dieser Massenspektren mit Massenspektraldatenbanken kann es möglich sein, die Bestandteile der Duftmarke vorläufig zu identifizieren. Durch den Einsatz eines Auto-Samplers sind wir in der Lage, mehrere Proben in Chargen konsistent zu analysieren.
Da jede Art von SPME-Faser eine unterschiedliche Affinität zu polaren Chemikalien aufweist, wird die Faser normalerweise in Abhängigkeit von der Polarität und / oder dem Molekulargewicht der chemischen Zielverbindungen ausgewählt. Darüber hinaus werden die GC-Bedingungen in Abhängigkeit von der Art der GC-Säule und den Eigenschaften der chemischen Zielverbindungen geändert.
Diese Technik ermöglicht die semi-quantitative Analyse der flüchtigen Bestandteile von Duftmarkierungen, indem sie die Trennung und vorläufige Identifizierung der Komponenten in der Probe ermöglicht, gefolgt von der Analyse von Spitzenflächenverhältnissen, um nach Trends zu suchen, die Komponenten der Duftmarkierung bezeichnen könnten, die an der Signalisierung beteiligt sein können.
Die wichtigsten Stärken dieses aktuellen Ansatzes sind:
- Der Bereich der Probentypen, die analysiert werden können.
- Es sind keine aufwändig-aufbereitung oder Extraktionen erforderlich.
- Die Fähigkeit, flüchtige Komponenten zu analysieren.
- Die Fähigkeit, die Komponenten einer Mischung zu trennen.
- Um die erkannten Komponenten identifizieren zu können.
- Die Fähigkeit, semi-quantitative und potenziell quantitative Informationen über die erkannten Komponenten bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Kontrollproben, sowohl Umweltkontrollen, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme erstellt wurden, als auch Systemrohlinge, sind entscheidend für die Interpretation der Duftmarkenproben. Alle Peaks, die der Sampling-Umgebung oder dem Instrumentssystem zugeschrieben werden, müssen von den Duftmarkenproben ausgeschlossen werden, so dass nur die Peaks von Interesse in jede Interpretation einbezogen werden. Diese Kontrollen können auch eine Rolle bei der Bewertung und Überwachung des “Zustands” der Instrum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Keith Holding für seine Unterstützung bei chemischen Analysen am Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, und Ben Mantle für die Produktion des Videos. Wir danken auch Prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini und den Mitgliedern des Zentrums für Massenspektrometrie der Universität Florenz, Florenz, sowie Prof. Luca Calamai und Dr. Marco Michelozzi vom ARCA Lab des CNR, Florenz, für ihre Hilfe bei der Einrichtung dieser Methodik. Die Forschungsprojekte, die die im Manuskript beschriebenen Probenahme- und Analysemethoden beinhalteten, wurden durch zwei Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), einen kleinen Zuschuss (“The sensory enriched primate“) der Primate Society of Great Britain und einen kleinen Forschungsstipendium (“Dohunter-gatherers have a special sense of smell?”)von der British Academy/The Leverhulme Trust an S.V. unterstützt. Die Laborarbeit, die für die Einrichtung dieser Methodik erforderlich war, wurde auch von der jährlichen Finanzierungskonkurrenz der Fakultät für Naturwissenschaften und Technik (Wolverhampton) an S.V. finanziert.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
