Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi
Summary
Koku sinyallerinin hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için örnekleme ve analiz için etkili bir metodoloji geliştirdik. Özellikle, hayvan kokularının ve koku işaretlerinin uçucu bileşenlerini analiz etmek için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikrokstrasyonu kullanıyoruz.
Abstract
Hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikroextraction kullanarak koku sinyallerinin örneklemesi ve analizi için etkili bir metodoloji geliştirdik. Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz bir şekilde tanımlanmasını sağlayarak koku salgılarının uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceği bileşikleri işaret edebilecek eğilimleri aramak için tepe alan oranlarının analizine olanak tanır. Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri, analiz edilebilen örnek türlerin aralığıdır; herhangi bir karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyona ihtiyaç duymaması; bir karışımın bileşenlerini ayırma ve analiz etme yeteneği; algılanan bileşenlerin tanımlanması; ve tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği. Metodolojinin ana sınırlaması örneklerin kendisiyle ilgilidir. Belirli ilgi bileşenleri uçucu olduğundan ve bunlar kolayca kaybolabileceğinden veya konsantrasyonları değiştirilebileceğinden, numunelerin toplanmasından sonra uygun şekilde depolanıp taşınması önemlidir. Bu aynı zamanda örnek depolama ve taşıma koşullarının nispeten maliyetli olduğu anlamına gelir. Bu yöntem çeşitli örneklere (idrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları dahil) uygulanabilir. Bu kokular, bir dizi matriste meydana gelen karmaşık karışımlardan oluşur ve böylece bireysel bileşenleri ayırmak ve biyolojik ilgi bileşiklerini çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektirir.
Introduction
Hayvanlardaki koku sinyallerini destekleyen kimyasal değişiklikler hakkında çok az şey bilinmektedir1, ayrıca kokuların uçucu kimyasal profillerinin kaydedilmesi ve ölçülmese metodolojik zorluklar nedeniyle2. Son derece karmaşık, kimyasal matrislerle çalışırken birkaç potansiyel tuzak vardır; bunlar koku örneklerini örnekleme ve analiz ederkeniçerir 3.
Wolverhampton Üniversitesi Rosalind Franklin Bilim Merkezi’nde, kokuların ve koku izlerinin hayvanlar tarafından nasıl kullanılabileceğini anlamak için analizini yapıyoruz. Yarı-biyoseksiktriyi davranışsal ekoloji, endokrinoloji ve sitoloji ile birleştirerek koku sinyallerinin hayvan iletişiminde oynadığı rolü anlamamızı geliştiriyoruz.
Bir metodoloji geliştirdik ve daha sonra birkaç insan dışı primat (yani taçlı lemurlar, kırmızı-fırfırlı lemurlar, Japon makaklar, zeytin babunları, şempanzeler) ve diğer memeliler (örneğin kediler, inekler) dahil olmak üzere çeşitli türlerin kokularını ve işaretlerini analiz ettik. İdrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları da dahil olmak üzere çeşitli örnekleri topladık ve analiz ettik. Bu kokular ve koku işaretleri karmaşık bileşik karışımlarından oluşur ve bu nedenle analizleri için kullanılan herhangi bir metodolojinin bir tür ayırıcı teknik içermesi gerekir. Gösterildiği gibi, ilgi çekici bileşenleri çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektiren bir dizi matriste de ortaya çıkarlar.
Vaglio ve ark.4 ve diğer yazarlar tarafından yapılan önceki çalışmalar5 gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile dinamik kafa boşluğu ekstraksiyonu (DHS) kullanılırken, doğrudan solvent ekstraksiyonu6 ve karmaşık solvent ekstraksiyonları7 de kullanılmıştır. Özellikle, dinamik kafa boşluğu örneklemesi, numune matrisi için güçlü bir yakınlık gösterenler (örneğin, sulu numunelerdeki kutup bileşikleri) hariç, sonuçta tüm uçucu bileşikleri kaldıran bilinen bir inert gaz hacmi ile kafa boşluğunun temizlenmesini içerir.
Mevcut metodoloji için, GC-MS ile birlikte headspace katı faz mikroextraction (HS-SPME) tekniğini benimsedik. Özellikle, Vaglio ve arkadaşları tarafından önceki GC-MS laboratuvarında 8 ,9,10’dazaten kullanılan metodolojiyi geliştirdik ve geliştirdik.
Solventsiz ekstraksiyon teknikleri, küçük, yüksek uçucu bileşikleri analiz etmek için çok etkilidir (aksi takdirde bir numuneden kolayca kaybolabilir) çünkü bu yöntemler bileşikleri kararlı, katı faz desteği üzerinde hareketsiz hale getirebilir. HS-SPME, numune kafa boşluğundaki uçucu bileşikleri yakalamak veya sulu bir biyolojik sıvıya daldırarak çözünmüş bileşikleri çıkarmak için adsorbent polimer ile kaplanmış bir elyaf kullanır11. Polimer kaplama bileşikleri güçlü bir şekilde bağlamaz, bu nedenle GC’nin enjeksiyon portunda ısıtarak çıkarılabilirler. Bu yöntem solvent ekstraksiyon tekniklerinden daha güçlüdür ve dhs’den daha etkilidir.
Mevcut yaklaşımda numuneler cam şişeler içinde bulunur. Bu şişeler, şişenin baş boşluğunda yer kaplamak için koku işaretinin uçucu bileşenlerini teşvik etmek için hayvan vücut sıcaklığını simüle etmek için 40 ° C sıcaklığa ısıtılır. 65 μm polidimetilsiloksisan/divinylbenzene (PDMS/DVB) sorbent malzeme ile kaplanmış bir SPME elyafı kafa boşluğu ortamına maruz kalır ve numuneden uçucu bileşenler fiberin üzerine adsorbe edilir. Bir GC-MS’in giriş portunda fiberin ısıtılmasında, uçucu bileşenler fiberden desorbe edilir ve daha sonra GC ile ayrılır. MS kullanılarak her bileşen için kütle spektral parçalanma desenleri elde edilir. Bu kütle spektrumlarının kütle spektral veritabanları ile karşılaştırılmasıyla, koku işaretinin bileşenlerini belirsiz bir şekilde tanımlamak mümkün olabilir. Otomatik örnekleyici kullanarak, birden fazla örneği toplu olarak tutarlı bir şekilde analiz edebiliyoruz.
Her bir SPME lifi türünün kutup kimyasalları ile farklı bir yakınlığı olduğu göz önüne alındığında, lif genellikle hedef kimyasal bileşiklerin polaritesine ve / veya moleküler ağırlığına bağlı olarak seçilir. Ek olarak, GC koşulları GC sütununun türüne ve hedef kimyasal bileşiklerin özelliklerine bağlı olarak değiştirilir.
Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz tanımlanmasını sağlayarak koku işaretlerinin uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceğini belirten koku işaretleme bileşenlerini işaretleyebilecek eğilimleri aramak için tepe alanı oranlarının analizine olanak tanır.
Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri şunlardır:
- Analiz edilebilen örnek türleri aralığı.
- Karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyon gerekmez.
- Uçucu bileşenleri analiz etme yeteneği.
- Bir karışımın bileşenlerini ayırma yeteneği.
- Algılanan bileşenleri tanımlayabilmek.
- Tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontrol örneklerinin kullanımı, hem numune toplama sırasında oluşturulan çevresel kontroller hem de sistem boşlukları, koku işareti örneklerinin yorumlanması için çok önemlidir. Örnekleme ortamına veya enstrümantal sisteme atfedilen tüm zirvelerin koku işareti örneklerinden dışlanması gerekir, böylece herhangi bir yoruma yalnızca ilginin zirveleri dahil edilir. Bu kontroller, enstrümantasyonun ‘sağlığının’ değerlendirilmesinde ve izlenmesinde de rol oynayabilir.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keith Holding’e Rosalind Franklin Bilim Merkezi, Wolverhampton ve Ben Mantle’daki kimyasal analizlere yaptığı yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini ve Floransa Üniversitesi Kütle Spektrometre merkezi üyelerine ve CNR’nin ARCA Lab, Floransa’dan Prof. Luca Calamai ve Dr. Marco Michelozzi’ye bu metodolojinin kurulmasına yardımcı oldukları için minnettarız. Makalenin örneklemesi ve analiz yöntemlerini içeren araştırma projeleri, iki Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), Büyük Britanya Primat Derneği’nden küçük bir hibe (‘Duyusal zenginleştirilmiş primat‘) ve küçük bir araştırma hibesi (‘Avcı-toplayıcıların özel bir koku alma duyusu var mı?‘) İngiliz Akademisi/Leverhulme Vakfı’ndan S.V. Bu metodolojiyi kurmak için gereken laboratuvar çalışmaları, Fen Ve Mühendislik Fakültesi Yıllık Finansman Yarışması’ndan (Wolverhampton) S.V.’ye de finansman sağladı.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
