Summary
본 의정서에서는, 점막 조직에 있는 바이러스성 감염을 모방하고 활성화시 선천적인 면역 반응을 공부하기 위하여 부분적인 외과 편도선 절제술을 겪고 있는 건강한 인간에게서 편도선 단핵 세포를 쉽게 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다.
Abstract
점막 관련 림프조직(MALT)에서 분리된 세포를 연구하면 조직에서 숙주 병원체 상호 작용을 모델링할 수 있기 때문에 점막 면역과 관련된 병리학에서 면역 세포 반응을 이해할 수 있습니다. 조직에서 유래된 분리된 세포는 첫번째 세포 배양 모형인 동안, 조직이 얻기 어려울 수 있기 때문에 그들의 사용은 무시되었습니다. 본 의정서에서는 건강한 인간 편도선으로부터 편도선 단핵세포(TMC)를 쉽게 처리하고 배양하여 활성화 시 선천적인 면역 반응을 연구하고 점막 조직의 바이러스 감염을 모방하는 방법을 설명합니다. 편도선에서 TMC의 격리는 빠르다, 편도선은 거의 어떤 상피를 가지고 모든 주요 면역 세포 유형의 수십억까지 항복하기 때문에. 이 방법은 혈액에서 말초 단핵 세포 (PBMC)의 사용과 유사한 면역 분석, qPCR, 현미경, 유동 세포 측정 등을 포함한 여러 기술을 사용하여 사이토카인 생산을 검출 할 수 있습니다. 또한, TMC는 미래의 독성 검사에 대해 고려해야 할 PBMC보다 약물 검사에 더 높은 민감성을 보여줍니다. 따라서, ex vivo TMC 문화는 쉽고 접근 가능한 점막 모델입니다.
Introduction
인간의 장기에 대한 연구는 접근성뿐만 아니라 명백한 윤리적 이유로 인해 제한됩니다. 그러나, 그(것)들은 인간 생물학의 복잡성을 완전히 이해하기 위하여 필수적입니다. 고립 된 세포의 배양 (1 차 배양 또는 세포주) 그들의 가용성 때문에 세포 생물학 연구에 표준 시스템. 고립 된 세포 배양은 뛰어난 발견을 허용했지만 생체 기관의 생물학에서 완전히 모방하지 않기 때문에 세포주를 사용하는 것은 면밀한 조사를 받고 있습니다. 그러나, 3차원 세포 또는 조직 이종의 배양은 매우4복잡4,5,,6이다. 실제로, 조직 이나 장기의 조각은 매우 이종성 때문에 그것의 세포 구성 조직에 국소화에 따라 다릅니다. 따라서 조직 블록을 사용하면 많은 기술적 및 생물학적 복제의 분석이 필요하며 많은 수의 기증자 또는 환자가 필요합니다.
점막 관련 림프조직(MALT)은 림프절과 구조적으로 유사하지만 점막 면역7을조절하는 것이 주된 역할이기 때문에 독특한 기능을 가지고 있다. 일반적으로 조직에서 어느 정도 떨어진 곳에 위치한 림프절과 달리, 몰트는 일반적으로 점막 조직의 상피 바로 아래에 위치합니다. 조직학적으로, 그들은 주로 B와 T 세포의 고농도로 구성되지만 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포도 구성됩니다. 몰트는 인체에 있는 림프구 조직의 대략 50%를 구성합니다. 몰트는 그들의 위치에 따라 9개의 그룹으로 세분화됩니다: GALT (창자-), BALT (기관지-), NALT (비강), CALT (결막), LALT (후두), SALT (피부), VALT (불보-), O-MALT (조직), D-MALT (확산). O-MALT는 주로 Waldeyer의 편도선 링의 편도선으로 구성되어 있으며 가장 접근 하기 쉬운 MALT8,,9입니다. 실제로, 오로하린에 위치한 편도선은 (잠재적) 침습적미생물(10)으로부터소화 및 호흡기를 보호하는 주요 장벽을 구성한다. 또한 편도선은 혈관, 신경 및 림프를 포함하는 결합 조직의 캡슐에 의해 지원되는 미세 한 층상 편평상피비상각성 상피로 덮여 있어 면역세포(11,12)에12쉽게 접근할 수 있다. 또한 편도선 절제술은 편도선 제거의 수술로, 수면 장애 호흡을 가진 어린이에게 수행되는 일반적인 절차로, 편도선은 생리적 환경에서 쉽게 사용할 수 있는조직(13)입니다.
편도선은 점막 면역을 관련시키는 병리에서 면역 세포 반응의 연구를 허용합니다. 실제로, HIV 감염에서는 편도선이 고농도의 면역 세포로 구성되기 때문에 바이러스 복제의 주요 대상이지만순환(14,,15)에서검출되지 않는 다량의 사이토카인을 생성한다. 꾸준한 상태에서, 선천성 같이 세포의 희소한 인구는 편도선을 포함하여 각종 점막 조직에 존재합니다, 그러나 본질적으로 혈액에서 결석합니다.
따라서 편도선(TMC)의 단일 핵 세포는 PBMC보다 관련성이 높으며 복잡한 모델이며 더 심오한 질문에 답할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 조직 이출의 사용은 복잡할 수 있고 항상 타고난 면역 연구 결과와 관련되지 않을 수 있습니다. 따라서, TMC16을사용하여 점막 면역 활성화를 연구하는 모델을 확립했다. 여기서는 신선한 인간 편도선에서 TMC를 효율적으로 격리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 전 생체 내 연구에 대한 무결성을 유지하면서 많은 수의 면역 세포를 복구 할 수 있습니다.
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Protocol
표본은 연구 목적을 위해 특별히 수집되지 않으며 연구 결과는 침략적인 것으로 간주되지 않습니다. 그러나 인간 편도선 수집은 지역 관계 당국의 윤리적 승인이 필요합니다. 우리의 경우, 그것은 코미테 드 보호 데 페르소네스 (IDRCB / EUDRACT: 2018A0135847)에 의해 승인되었다. 또한, 각 환자 또는 법정 대리인의 동의는 실험 결과를 해석하는 데 도움이 될 수 있는 기증자의 개인 데이터(예: 성별, 연령, 이력)를 획득하도록 요청됩니다.
1. 인간 편도선 조직 취급
- 모든 기증자의 편도선에 25mL PBS 1x를 함유한 멸균 50mL 바이알 1개에 넣고 실온(RT)에서 실험실로 이송합니다(바이알, 안전 상자 및 가방 의 세 가지 수준의 보호 를 사용).
참고: 전체 절차는 생물학적 안전 수준 2 실험실에서 수행되어야합니다. 모든 인간 표본은 이전에 자격을 갖추지 못했으며 전염성 요원을 포함할 수 있기 때문에 주의하여 처리되어야 합니다. -
각 사용 사이에 모든 도구를 청소합니다.
- 사용 후, 세포 스트레이너를 분해하고 세제 용액 (H2O의1/10 부피 세제)을 포함하는 욕조에서 다른 모든 악기 (예 : 유봉, 집게)를 밤새 보관하십시오.
- 각 기구를 브러시하여 조직을 제거하고 맑은 물로 씻습니다.
- 모든 부품을 잘 건조한 다음, 10메쉬 스틸 그리드 위에 60메쉬 스틸 그리드를 배치하여 셀 스트레이너(85mL, 37mm 직경)를 준비하고 링을 단단히 닫습니다.
- 모든 도구를 멸균 백과 오토클레이브에 놓습니다.
2. 편도선 단핵세포의 인간 편도선 조직 및 격리의 해부(TMC)
- 세포 스트레이너를 150 x 25mm2 2(SPL150) 세포 배양 접시에 놓고 모든 계측기를 다른 SPL150에 배치하여 멸균상태를 유지합니다.
- 멸균 포셉을 사용하여 유리병에서 세포 여조로 편도선을 옮김합니다. 또한 편도선을 퇴각한 일부 세포를 포함하는 모든 PBS에 부어 넣습니다. 필요한 경우 더 많은 PBS를 추가하여 그리드에 몰입합니다.
참고: 조직은 탈수를 피하기 위해 항상 침지해야합니다. - 포셉과 메스를 사용하여 소작, 피 묻은 및 자궁 근종 조직을 제거하십시오.
참고: 어린이에게서 제거된 편도선은 이 단계가 필요하지 않습니다. - 메스와 구부러진 핀셋을 사용하여 직경 이0.5cm 미만의 작은 조각으로 조직을 잘라냅니다. 작은 조각이 항상 침지 될 수 있도록 모든 조직을 잘라.
- 세포 스트레이너에 조직의 몇 조각을 놓고 흰색 스트로마의 정말 얇은 층이 남아있을 때까지 유리 유봉그리드에 긁어. 그리드가 막히는 것을 방지하기 위해 스트로마를 제거하고 버립니다.
- 모든 조직이 그리드를 통해 압착되면 10mL 파이펫을 사용하여 모든 셀 서스펜션을 그리드로 전송하고 마지막으로 긁어냅니다.
- 10mL 파이펫으로 셀 서스펜션을 멸균 바이알로 옮킨다. 그리드와 셀 스트레이너를 PBS 1x로 세척합니다. 셀 서스펜션을 벤치에서 RT에서 5분 동안 쉬게 하십시오. 이 단계는 남은 스트로마, 죽은 세포 및 방출 된 DNA의 강수및 응집을 허용하고 다음 단계를 용이하게합니다.
- 멸균 70 μm 체를 새로운 50mL 유리병 위에 놓고(봉투에서 조심스럽게 제거) 셀 서스펜션을 10mL 파이펫으로 부드럽게 전달합니다. 펠릿이 자주 존재하기 때문에 서스펜션을 혼합하지 마십시오. 체가 막힌 경우 멸균 1 mL 파이펫 팁의 뒷면을 사용하여 체에 세포를 긁어 넣습니다. 필요에 따라 체를 자주 변경합니다.
- 4°C에서 10분 동안 250 x g의 세포를 원심분리합니다.
- 상체를 버리고 유리병을 부드럽게 혼합하여 펠릿을 다시 한 다음 PBS의 35 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.
- 새로운 바이알에서 새로운 70 μm 체를 위에 놓고 셀 서스펜션을 10mL 파이펫으로 전달합니다. 체가 막힌 경우 2.7 단계에서 자세히 설명된 기술을 사용하십시오.
3. 세포 밀도 그라데이션에 의한 TMC 의 격리
참고: TMC는 2.10 단계 후에 사용할 수 있습니다. 그러나, 더 명확한 세포 용액을 얻고 다른 세포 이물질 및 임의의 적혈구를 제거하기 위하여, 단핵 세포의 세포 밀도 그라데이션 절연을 능력을 발휘하는 것이 좋습니다.
- 새로운 50mL 바이알에 밀도 그라데이션 배지(d = 1.076 g/mL)의 15mL을 추가합니다. 밀도 그라데이션 매체 위에 TMC 솔루션을 붓고 밀도 그라데이션 매체와 서스펜션의 혼합을 최소화하도록 주의하십시오.
- 원심 분리는 가속과 브레이크 오프RT에서 30 분 동안 1,000 x g에서 솔루션을 제공합니다.
- 10mL 파이펫으로 제거하고 TMC와 밀도 그라데이션 매체 사이의 인터페이스를 방해하지 않고 상위 층(대부분 PBS 1x 포함)을 폐기합니다.
참고: TMC에는 적혈구수가 적어 지므로 용액이 분명합니다. 따라서 PBS의 TMC 용액과 밀도 그라데이션 매체 사이의 인터페이스는 시각화가 어려울 수 있다. 이에 따라 밀도 그라데이션이 수행되기 전에 20m HEPES(FBS 제외)로 보충된 RPMI 1640에서 세포를 재장전할 수 있다. - 멸균 1mL 파이펫 팁으로 TMC를 제거하고 새로운 50mL 바이알에 넣습니다.
- 태아소 세럼(FBS)의 2%를 함유한 PBS 50mL와 2mM EDTA 및 원심분리기를 4°C에서 g 10분 동안 250xg로 첨가하여 세포를 세척하여 나머지 혈소판을 제거한다.
- 반복 단계 3.5, 하지만 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 튜브원심분리.
- 10% 열 불활성 FBS, 2mM L-글루타민 및 항생제 용액(100 U/mL 페니실륨 및 100 μg/mL 연쇄 절제술)으로 RPMI 1640을 보충하여 배양 배지(R10)를 준비한다.
- R10의 10mL에서 TMC를 다시 중단하고 셀을 계산합니다. 평균적으로 이 기술은 편도선 한 켤레당 5 x 108-2 x 109 TMC를 생성합니다. 세포는 이제 전혈(예: 특정 세포 형, 세포 배양, 유동 세포측정, RT-qPCR, 동결 등)에서 PBMC와 같은 조사에 사용될 수 있다.
-
필요한 경우 1 차 세포 동결을위한 표준 기술을 사용하여 추가 사용을 위해 세포를 동결하십시오.
- 셀 수를 계산합니다.
- 세포를 원심 분리하고 상신을 제거합니다. 1 x 108 셀/mL의 최종 농도를 위해 충분한 100% FBS에 펠릿을 녹인 다음 동일한 부피를 80% FBS + 20% DMSO 용액으로 추가합니다. 그런 다음 셀은 5 x 107 셀 /mL에 있을 것입니다. 이 단계는 4°C에서 수행해야 하며 FBS 및 DMSO 용액은 사용하기 전에 4°C로 유지되어야 합니다.
- 셀 용액의 1mL를 냉동튜브에 분배하고 세포 동결 속도를 제어하기 위해 하룻밤 사이에 4 °C에 있는 느린 동결 용기에 넣습니다. -80 °C에 놓습니다.
- 세포를 해동하려면, 일정한 동요와 함께 몇 초 동안 37 °C에서 따뜻한 목욕에 극저온을 놓습니다. 세포가 해동되기 시작하자마자 R10 및 원심분리기의 49mL로 전송하여 DMSO를 제거합니다. 셀을 계산하고 이를 PBMC로 사용합니다.
참고: TMC를 동결하고 해동하면 이물질을 제거하지만 일부 희귀 세포 유형도 손상됩니다. 해동 후 덩어리 나 파편이 존재하는 경우, 그것을 사용하기 전에 멸균 70 μm 체를 통해 세포 현탁액을 통과하는 것이 가장 좋습니다.
4. 흐름 세포측정에 의한 TMC의 페노티핑
- 5 mL 세포측정관에 시험하고 배치해야 하는 각 항체 혼합물 패널에 대한 이전 용액에서 5 x 106 세포를 검색합니다. 스테인드되지 않은 컨트롤을 위해 1 x 106 셀을 검색합니다.
- PBS 및 원심분리기의 세포를 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 세척합니다. PBS의 500 μL (1 x 106 세포 /mL)에서 그들을 다시 중단하고 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 생존 얼룩으로 인큐베이션하십시오.
- 셀 서스펜션 100 μL 당 5 μL 열 비활성화 된 인간 AB 혈청을 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 15 분 동안 배양하십시오.
- PBS + 2 % FBS + 2 mM EDTA (워시 버퍼) 및 원심분리기400 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 세포를 세척하십시오.
- 표 1에상세한 바와 같이 항체를 포함하는 500 μL의 세척 버퍼에서 TMC를 다시 중단한다. 어둠 속에서 4 °C에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오.
- 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 세척 버퍼및 원심분리기에서 셀을 세척합니다. 파라포름알데히드(PFA)의 0.5%를 포함하는 PBS의 500 μL에서 TMC를 다시 중단합니다. 혈류 세포측정에 의해 획득 될 때까지 4 °C에서 어둠 속에서 유지하십시오.
참고: PFA는 위험합니다. 상용 즉시 사용할 수 있는 솔루션을 사용하여 0.5% PFA 솔루션을 준비합니다.
| 항 체 | 복제 | 플루오로크롬 | 회사 |
| 라이브 데드 | BV405 | 써모피셔 과학 | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD 파밍겐 |
| CD8 | SK1 | 아맥얀 | BD 파밍겐 |
| CD8 | BW135/80 | 비오블루 | 밀테니 바이오텍 |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD 파밍겐 |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | 베크만 쿨터 |
| CD20 | 2H7 | 알렉사 플루어 700 | BD 파밍겐 |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD 파밍겐 |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD 파밍겐 |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD 파밍겐 |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD 파밍겐 |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD 파밍겐 |
| BDCA-1 | L161 | 퍼시픽 블루 | BD 파밍겐 |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | 밀테니 바이오텍 |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | 밀테니 바이오텍 |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD 파밍겐 |
| CD11c | 3.9 | 알렉사 플루어 700 | 에바이오사이언스 |
표 1: 유동 세포측정에 의한 세포 특성화를 위한 항체 목록.
5. TMC 활성화 및 사이토카인 생산 측정의 예
- R10 배지에서 TMC를 희석하여 2 x 106 셀/mL의 농도를 얻습니다.
- R10 의 200 μL에 400,000 TMC를 96 개의 잘 둥근 하단 플레이트에 배포합니다.
- 세포를 활성화하려면 TLR7/8 작용제 레시퀴모드(R848)의 5μg/mL을 하룻밤 사이에 추가합니다.
- 플레이트원심분리기를 원심분리하고 TMC의 상체를 검색하여 추가 분석을 위해 동결합니다. 사이토카인 생산은 제조업체의 프로토콜에 따른 유동 사이토미터를 사용하여 동시에 다중 수용성 사이토카인을 정량화하기 위해 비드 기반 면역 분석제를 사용하여 평가될 것이다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 발광 세포 생존 가능성 분석기를 사용하여 세포의 생존 가능성을 평가합니다. 간단히, 우물에 세포 생존용액 60 μL을 추가하고 10 분 이내에 발광을 측정합니다 (1 s / 잘 획득).
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Representative Results
우리는 먼저 배양에 존재하는 세포의 면역 프로파일을 특성화하고 TMC의 양을 분석했습니다. 우리는 유동 세포측정을 사용하여 편도선에서 TMC를 표현했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 혈액으로부터 PBMC에 존재하는 모든 주요 면역 세포 유형은 편도선으로부터 TMC에서 나타내고 있었다. 그러나, TMC에서 B 세포를 제외한 모든 세포 유형의 빈도는 PBMC보다 낮았다.
그림 1: 편도선에서 TMC의 표토. 건강한 기증자로부터 TMC는 인간 편도선 조직의 해부 및 세포의 격리 후에 얻어졌습니다. (A)세포는 염색되었고, 데이터는 혈류 세포측정에 의해 획득되었다. 데이터는 대표적인 실험을 나타냅니다. (B)표는 6개의 다른 건강한 기증자로부터 편도선에 있는 살아있는 TMC에 있는 각 세포 모형의 백분율을 요약하고 문헌18,,19에정의된 것과 같이 혈액에서 PBMC에 있는 각 세포 모형의 백분율과 각각 비교합니다. 데이터는 라이브 셀 SD의 백분율로 표시됩니다.
그런 다음 TMC의 면역 반응을 테스트했습니다. 병원체에 대한 세포의 활성화를 재현하는 한 가지 방법은 톨 라이코 수용체 (TR) 제품군에서 타고난 면역 센서를 자극하는 것입니다. TR은 주로 단핵구/대식세포, 모든 수지상 세포(DC) 특수형, 혈장 세포 수지상 세포(pDC), 및 B 세포에도 존재한다. 이 예에서, 우리는 TLR7 및 TLR8을 공부했습니다, 왜냐하면 그들은 항 바이러스 반응을 전문화하고 편도선염의 대부분의 경우 (즉, 편도선 감염)는 바이러스 감염에 기인합니다. 따라서, 7명의 건강한 기증자로부터 편도선(그래프 인 블루)에서 TMC는 TLR7/8 리간드 레스시퀴모(R848)로 밤새 자극되었다. PbMC에서와 같이 (녹색그래프), TLR7/8 신호를 통한 활성화는 I 형 인터페론(IFN) 및 염증성 사이토카인의 생산을 유발했습니다. 실제로, 활성화 시동동은 주로 바이러스 감염에 대한 타고난 면역에 관여하고 대부분 pDC에 의해 생성되는 타입 I IFN 제품군의 일원인 IFNα이다. IFN2/3 및 IL-8을 제외한 모든 사이토카인은 TMC에 의해 생산되었지만, 흥미롭게도 일부 사이토카인(주로 IL-8, IL-6, IL-10 및 TNFα)은 기저 수준에서 더 많은 양을 존재하였다. 더욱이, 우리는 이전에 설명된 바와 같이 제조된 단상 형 조직 블록에 의해 단상TMC 또는 편도선 조직 블록에 의해 생성된 사이토카인을비교하였다. 앞서17일 설명한 대로 STING-37 세포주 기자 분석체를 이용하여 두 세포배양에서 생산된 모든 유형의 IFN을 측정하고, 고립된 TMC에서 IFN 수준만 측정할 수 있음을 보여주었다.
그림 2: TMC는 자극 시 사이토카인을 생산했습니다. (A)정제 및 절연 된 TMC (파란색) 및 PBMC (녹색)는 R848 (5 μg /mL)로 밤새 자극되었다. 수퍼넌트는 사용전까지 검색및 냉동되었습니다. 비드 계 면역 분석은 유동 사이토미터를 사용하여 동시에 다중 수용성 사이토카인을 정량화하기 위해 수행되었다. 그래프는 각 측정 된 사이토카인의 밀리리터 당 피코그램의 농도를 나타냅니다. 접이식 증가는 그래프에 빨간색으로 음추가 표시됩니다. 만 휘트니 U 테스트. (B)편도선(blue) 및 편도선 조직 블록(orange)으로부터 정제 및 격리된 TMC가 인플루엔자 A 바이러스(IAV)로 24시간 동안 자극되었다. STING-37 기자 세포주 분석체는 상체에서 IFN 생산을 측정하는 데 사용되었다. 상자와 수염은 최대까지 ± 최소한값으로 플롯됩니다. 만 휘트니 U 테스트. P < 0.001, **P & 0.01, *P & 0.05. NS = 자극되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, 우리는 TMC의 생존 가능성을 테스트했습니다. 셀 생존 가능성을 측정하는 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 여기서, 우리는 발광 세포 생존 성 분석, 쉽고 빠른 2 단계 분석서를 사용했습니다. 도 3에도시된 바와 같이, PBMC에 독성이 없는 TMC에서 화합물 1에 의해 유도된 세포 독성을 명확하게 검출했습니다. 따라서, TMC는 시험된 약에 더 높은 감도를 보였다.
그림 3: 화합물 1은 TMC에 독성이 있었다. 정제 및 절연 된 TMC 및 PBMC는 1 h에 대한 다양한 농도에서 화합물 1 (C1)으로 미리 배양 된 다음 R848 (5 μg /mL)으로 밤새 자극하였다. 수퍼나탈제는 회수되었고, 60μL의 세포 생존용액이 첨가되었고, 발광을 측정했다. *는 C1과 NS를 비교하는 통계 분석을 나타냅니다. 상자와 수염은 최대까지 ± 최소한값으로 플롯됩니다. 크루스칼-월리스는 던의 포스트 호크 교정으로 테스트한다. P < 0.0001, ***P & 0.001, **P & 0.01, *P < 0.05. NS = 자극되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 편도선은 점막 계면에서 타고난 면역 반응을 연구하기 위한 통합 및 생리학적 전 생체 모델을 나타내며, 이는 이차 림프구 기관의 역할을 모방하기 때문이다. 흥미롭게도, TMC의 세포 조성은 PBMC와 유사하며 혈액으로부터 PBMC와 다를 수 있지만 모든 주요 세포 집단을포함한다(도 1). 추가 인구는 또한 발견될 수 있습니다, 모든 면역 반응은 조직에서 시작되기 때문에 (점막 또는 이차 림프구 기관) 혈액에서 하지.
인간 조직의 사용뿐만 아니라 세포 배양 또는 혈액 세포의 사용은 각각 자신의 장점이 있다. 그러나, 연구 사이토카인 분비 및 세포 활성화의 경우, 조직 이식은 최고의 모델이 아니었다. 사실, 우리는 조직 이출의 상부에서 어떤 IFN 생산을 감지 할 수 없습니다(도 2B). 우리는 그것이 직접 주변 세포에 의해 소비되는 것을 추측합니다. 한편, 혈액 세포의 자극 (PBMC)은 감염에 대한 1 차적인 반응을 모방 할 수 있지만 대부분의 사이토카인이 생성되고 바이러스가 복제되는 조직에서 일어나는 일을 모방하지 않습니다. 따라서, 우리는 이차 림프구 조직, 편도선에서 발생하는 세포를 분리하고 정화하는 프로토콜을 설정했습니다. 우리는 건강한 인간 편도선에서 TMC를 정제하여 자극 시 면역 세포 활성화를 조사 할 수 있습니다. 그러나, 이 모델의 한계 중 하나는 TMC가 TLR7/8 자극시 PBMC로 많은 프로 염증 성 사이토카인을 생산하지 않는다는 것입니다.
TMC 대 PBMC에 대한 화합물 독성에 대한 연구는 TMC가 독성 약물에 더 민감하다는 것을밝혔다(그림 3). 따라서, 새로운 약및 미래 처리의 독성은 세포주, PBMC, 또는 조직 이질에서 뿐 아니라 조직에서 세포에서 시험되어야 합니다. 따라서 약물 검사를 위해 TMC를 사용하는 것은 향후 설명된 방법의 적용인 것으로 보인다.
성인 또는 어린이의 편도선은 설명된 대로 얻어서 처리될 수 있다. 그러나, 우리는 두 가지 주요 이유로 어린이로부터 편도선을 얻는 것이 좋습니다 : 1) 어린이 편도선은 성인의20보다더 많은 세포를 포함합니다. 실제로 편도선 비대는 어린 시절 바이러스와 싸우기 때문에 어린이에게 특히 일반적입니다. 따라서, 이러한 큰 편도선은 폐쇄성 편도선이 될 수 있으며 수면무호흡증(13)과같은 합병증을 피하기 위해 부분 편도선 절제술에 의해 제거될 필요가 있다. 2) 성인의 편도선이 일반적으로 귀 코 인후 (ENT) 감염의 여러 에피소드 후에 제거되기 때문에, 이 편도선은 더 적은 순진하고 더 적은 세포를 포함합니다.
제거 수술 후 가능한 한 빨리 편도선에서 작업하는 것이 중요합니다. 실제로 제거 직후와 해부까지 각 측의 편도선이 PBS 약 20mL를 포함하는 50mL 멸균 바이알에 함께 유지되므로 완전히 침수됩니다.
인더번드 간 변동성은 재현성을 위한 주요 문제를 나타낼 수 있습니다. 실제로, 기증자 사이 세포 조성에 있는 가변성은 중요할 수 있습니다. TMC를 사용하고 조직 이출이 아닌 당사의 프로토콜은 전체 편도선에서 나오는 세포가 배양에 도금되고 배치되기 전에 혼합되기 때문에 이러한 가변성을 제한하며, 조직 이질은 조각이 동일한 시편 내의 다른 영역에서 발생하기 때문에 세포 구성의 기증자 가변성을 가져옵니다. 부분 편도선 절제술은 비염증성 편도선에서만 수행될 수 있으며, 이는 환자 간의 염증 상태 가변성을 제한합니다. 또한 다른 날에 수술로 제거된 편도선을 수집하는 것이 좋습니다. 우리는 명확하게 외과 의사와 인터 데이 변동성이 기증자 간 가변성보다 높다는 것을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 기관 국립 드 라 Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P)에 의해 지원되었다. H) 실험 및 N.B. 펠로우십 (AAP 2017 166). N.S.는 동호회ANRS(AAP 2016 1), 유럽 분자생물학기구 EMBO(LT 834 2017), 울름대학교 의과대학 의학학부의 스타트업 자금 조달 프로그램 "바우스타인", 도이치 포르스충스게마인샤프트 DFG(SM 544/1)의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
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