Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila
Summary
Drosophila ist ein weit verbreitetes experimentelles Modell, das für das Screening von Medikamenten mit potenziellen Anwendungen für die Krebstherapie geeignet ist. Hier beschreiben wir die Verwendung von Drosophila-Variegated-Augenfarbphänotypen als Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Drosophila
Abstract
Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu überprüfen, die für die Krebstherapie nützlich sein könnten. Die hier beschriebene Methode ist eine kostengünstige In-vivo-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen mit Drosophila. Die DX1-Sorte der Drosophila, die einen bunten Augenfarb-Phänotyp hat, der die Ausdehnungen der Heterochromatin-Bildung widerspiegelt und damit ein Werkzeug für einen heterochromatinfördernden Wirkstoff-Bildschirm bietet. Bei dieser Screening-Methode wird die Augenvariegation auf der Grundlage der Oberfläche der roten Pigmentierung quantifiziert, die Teile des Auges einnimmt, und auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet. Das Screening-Verfahren ist einfach und empfindlich und ermöglicht die Prüfung von Verbindungen in vivo. Arzneimittel-Screening mit dieser Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Heterochromatin fördernde Medikamente zu identifizieren, die positive Auswirkungen in Krebstherapeutika haben könnten. Die Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung von Heterochromatin fördern, könnte auch zur Entdeckung epigenetischer Mechanismen der Krebsentwicklung führen.
Introduction
Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Genexpression, bei der Regulierung der Chromosomensegregation während der Zellteilung und beim Schutz vor Genominstabilität1spielt. Heterochromatin gilt als Regulierer für die Genrepression und zum Schutz der Chromosomenintegrität bei der Zellmitose2,3. Es ist mit der Di- und Tri-Methylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me) während der AbstammungSverpflichtung4,5verbunden. Darüber hinaus wird die Rekrutierung von Chromodomain-Proteinen von Heterochromatin Protein 1 (HP1) auch als mit Heterochromatin und epigenetischer Unterdrückung der Genexpression6assoziiert. Diese Proteine sind wesentliche Bestandteile und Marker der Heterochromatinbildung.
Da die genomische Instabilität es Zellen ermöglicht, genetische Veränderungen zu erwerben, die die Karzinogenese fördern, wird Heterochromatin in der Krebsentwicklung immer stärker anerkannt und kann für dieKrebsbehandlung7,8ins Visier genommen werden. Derzeit gibt es keine Medikamente, die gut etabliert sind bei der Unterstützung der Heterochromatin-Bildung. Hier präsentieren wir eine einfache und schnelle und dennoch effiziente Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Das Screening erfolgt durch die Behandlung von Drosophila mit einer Bibliothek von kleinmolekularen Medikamenten. Diese Methode nutzt einen bunten Augenfarben-Phänotyp in der DX1Drosophila-Sorte, der von Heterochromatin-Spiegeln beeinflusst wird. DX1-Fliegen enthalten ein Tandem-Array von sieben P[lac-w]-Transgenen, die je nach Heterochromatinisierung die bunte Expression/Depression aufweisen, daher spiegelt das Ausmaß der Variegation in der Augenfarbe den Heterochromatinspiegel wider. Insbesondere konnte das zunehmende Heterochromatin durch den steigenden Anteil der bunten Augenfarbe (weißes Auge) nachgewiesen werden. Im Gegenteil, abnehmendes Heterochromatin würde durch den steigenden Anteil der P[lac-w] Transgenexpression (rotes Auge)9,10,11,12erkannt.
Daher nutzen wir dieses Drosophila-Transgensystem, das einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, da seine Expression direkt mit der Menge an Heterochromatin korreliert. Bei der Entdeckung von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Heterochromatinbildung zu fördern, können wir diesen Verdacht mit anderen Methoden wie Western Blot bestätigen. Diese heterochromatinfördernden Substanzen können in Zukunft für klinische Studien bei Patienten weiterentwickelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielt. Es wird immer mehr bei Krebs erkannt und kann als potenzielles Ziel für die Krebstherapie dienen15,16,17,18. Kleinmolekulare Verbindungen werden häufig in der Arzneimittelentwicklung aufgrund von Vorteilen bei der Herstellung, Konservierung und Stoffwechsel in menschlichen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken J. Birchler, E. Bach und dem Bloomington Drosophila Stock Center für verschiedene Drosophila-Sorten; das National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD Studenten wie Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza und Alex Chavez. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde durch ein Forschungsstipendium der American Thoracic Society an J.L. und die Finanzierung durch NIH: R01GM131044 an W.X.L. unterstützt.
Materials
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
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