Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano
Summary
A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.
Abstract
A barreira hematoencefálica (BBB) é formada por unidades neurovasculares (ULS) que protegem o sistema nervoso central (SNC) de uma série de fatores encontrados no sangue que podem interromper a delicada função cerebral. Como tal, o BBB é um grande obstáculo para a entrega terapêutica ao CNS. A acumulação de evidências sugere que o BBB desempenha um papel fundamental no início e progressão de doenças neurológicas. Assim, há uma necessidade tremenda de um modelo BBB que possa prever a penetração de medicamentos direcionados ao CNS, bem como elucidar o papel do BBB na saúde e na doença.
Recentemente combinamos tecnologias de células-tronco pluripotentes e induzidas para gerar um chip BBB totalmente personalizado para humanos. Esta nova plataforma exibe propriedades celulares, moleculares e fisiológicas adequadas para a previsão do transporte de drogas e moléculas através do BBB humano. Além disso, utilizando chips BBB específicos do paciente, geramos modelos de doença neurológica e demonstramos o potencial de aplicações preditivas personalizadas. Fornecido aqui está um protocolo detalhado demonstrando como gerar chips BBB derivados do IPSC, começando com diferenciação de células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas do IPSC (iBMECs) e resultando em culturas neurais mistas contendo progenitores neurais, neurônios diferenciados, e astrócitos. Também é descrito um procedimento para semeader células no chip de órgão e culização dos chips BBB fluxo de laminar controlado. Por fim, são fornecidas descrições detalhadas das análises de chips BBB, incluindo ensaios de permeabilidade paracelular para avaliação da permeabilidade de medicamentos e moléculas, bem como métodos imunocitoquímicos para determinar a composição dos tipos celulares dentro do chip.
Introduction
O BBB é uma barreira altamente seletiva que separa o CNS do sangue circulante. Protege funções cerebrais críticas de substâncias, fatores e xenobióticos potencialmente disruptivos, ao mesmo tempo em que permite o fluxo de nutrientes e outros metabólitos necessários para manter a homeostase cerebral1. O BBB é um NVU multicelular no qual pericytes, pés de ponta astrócitos e processos neuronais entram diretamente em contato com células endoteliais do cérebro (BMECs). Essas interações permitem que os BMECs formem propriedades de barreira especializadas que são suportadas por junções apertadas e aderentes2,3. A formação dessa barreira limita a passagem paracelular das moléculas, mas contém transportadores polarizados para transportar ativamente moléculas para o CNS ou voltar para o sangue1. Devido a essas propriedades de barreira únicas, o BBB constitui um grande obstáculo para a entrega de biofarmacêuticos no cérebro, e estima-se que menos de 5% das pequenas moléculas aprovadas pela FDA podem chegar ao CNS4.
Modelos animais têm sido amplamente utilizados para estudar a penetração do BBB e os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do BBB5. Enquanto os modelos animais representam fielmente o complexo multicelular no ambiente vivo, diferenças de expressão e atividade dos transportadores do BBB, bem como especificidade de substrato entre espécies muitas vezes impedem a extrapolação precisa de dados animais para humanos6. Assim, os modelos de base humana são fundamentais para estudar o BBB humano e para uso no desenvolvimento de medicamentos projetados para atingir o CNS. Essa necessidade torna-se ainda mais evidente com o crescente domínio de medicamentos biológicos e específicos do homem no campo do desenvolvimento farmacêutico. O acúmulo de evidências sugere que um BBB comprometido está associado a uma série de distúrbios graves da SNC, incluindo tumores cerebrais e doenças neurológicas7,8,9. Modelos humanos que refletem fielmente essas doenças têm o potencial de ambos 1) identificar novos caminhos que poderiam ser direcionados para o desenvolvimento de medicamentos e 2) prever a penetração do CNS, reduzindo assim o tempo e os recursos em estudos pré-clínicos e possivelmente diminuindo a taxa de falha nos ensaios clínicos.
Modelos in vitro têm sido amplamente implementados para estudar interações entre BMECs e outras células do NVU e realizar telas para possíveis drogas permeáveis bbb10. Para recriar aspectos-chave do BBB humano, os modelos in vitro devem apresentar propriedades fisiologicamente relevantes (ou seja, baixa permeabilidade paracelular e resistência elétrica tranportelial fisiologicamente relevante [TEER] em toda a monocamada endotelial). Além disso, o perfil molecular de um sistema in vitro deve incluir a expressão de sistemas de transporte funcional representativos. Normalmente, os modelos in vitro são compostos de células endoteliais que são co-cultivadas em uma membrana semipermeável com combinações de outras células NVU para melhorar as propriedades DO BBB11. Essa abordagem permite uma avaliação simples e relativamente rápida da funcionalidade da barreira e permeabilidade das moléculas. Tais modelos BBB baseados em células podem ser estabelecidos com fontes de células animais ou humanas, incluindo células isoladas de excisões cirúrgicas ou linhas BMEC imortalizadas.
Recentemente, protocolos para diferenciar células pluripotentes humanas em BMECs foram introduzidos como uma fonte atraente para os modelos BBB12,13. As BMECs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são altamente escaláveis, demonstram características morfológicas e funcionais cruciais do BBB humano e carregam a genética do paciente. Na cultura, os iBMECs formam um monocamada que expressa marcadores de junção apertados e exibe em complexos de junção apertados como vivo. Essas células também expressam marcadores BBB, incluindo o transportador de glicose BBB, transporte de glicose 1 (GLUT1). É importante ressaltar, e ao contrário de outras fontes alternativas de células para BMECs humanos, os iBMECs adquirem propriedades de barreira com valores tão altos quanto os medidos no vivo14,polarizam ao longo do eixo basolateral e expressam bombas de efflux funcionais. Além disso, o uso de iPSCs de diversos assuntos, ambos 1) saúda a oportunidade de testar aspectos do BBB de forma personalizada e 2) fornece uma fonte flexível para gerar tipos celulares adicionais do NVU. Gerar essas células a partir de uma fonte de célula sogênica para criar chips BBB personalizados também ajudaria na compreensão das diferenças interindividuais nas respostas medicamentosas, que é uma das principais causas de resistência ou resposta comprometida ao tratamento observado em estudos clínicos.
O uso de iBMECs como monocamadas em um prato ou em uma inserção transwell semi-permeável representa uma abordagem poderosa para a modelagem BBB. Esses sistemas tendem a ser robustos, reprodutíveis e econômicos. Além disso, análises funcionais como TEER e permeabilidade são relativamente simples de realizar. No entanto, os sistemas bidimensionais (2D) não conseguem recapitular a natureza 3D do tecido vivo, e eles não têm as forças de estresse fisiológicos fornecidas pelo sangue e células sanguíneas circulantes. Isso limita a capacidade do endotelo vascular nesses modelos de desenvolver e manter propriedades e funções intrínsecas do BBB.
Sistemas microengenheiros forrados por células vivas foram implementados para modelar várias funcionalidades de órgãos em um conceito chamado organ-on-chips. Ao recriar em arquitetura multicelular semelhante ao vivo, interfaces teciduais, microambientes físicoquímicos e perfusão vascular, essas plataformas microprojetadas geram níveis de funcionalidade tecidual e órgão sem possível com sistemas convencionais de cultura 2D. Também permitem alta resolução, imagem em tempo real e análise de perfis bioquímicos, genéticos e metabólicos semelhantes às células vivas no contexto in vivo de tecido e órgão. No entanto, um desafio particular do órgão-on-chip é que o design, fabricação e aplicação desses chips microengenheiros exigem experiência sapateira especializada que geralmente não tem em laboratórios acadêmicos biologicamente orientados.
Recentemente, combinamos tecnologias iPSC e organ-on-chip para gerar um modelo personalizado de chips BBB15,16. Para superar os desafios tecnológicos descritos, o Chip-S1 disponível comercialmente é usado em conjunto com o módulo cultural, um instrumento projetado para automatizar a manutenção dos chips de forma simples e robusta (Emulate Inc.). O chip BBB recria interações entre células neurais e endoteliais e alcança valores TEER fisiologicamente relevantes, que é medido por chips de órgãofeitos feitos medida com eletrodos de ouro integrados17. Além disso, o chip BBB exibe baixa permeabilidade paracelular, responde a sinais inflamatórios no nível do órgão, expressa bombas de efflux ativas e exibe transporte preditivo de biomarcadores solúveis e biofarmacêuticos. Notavelmente, os chips BBB gerados a partir de diversos indivíduos capturam as diferenças funcionais esperadas entre indivíduos saudáveis e pacientes com doenças neurológicas15.
O protocolo detalhado abaixo descreve um método confiável, eficiente e reprodutível para a geração de chips BBB humanos baseados em iPSC em condições dinâmicas de fluxo. A orientação é fornecida sobre o tipo de ensaios e análises de endpoint que podem ser realizadas diretamente no chip BBB ou a partir de efluentes amostrais. Assim, o protocolo demonstra o espectro de técnicas que podem ser aplicadas para avaliação de propriedades biológicas e funcionais e respostas em um modelo humano-relevante.
Uma breve descrição do chip BBB baseado no IPSC é fornecida aqui. Os iPSCs humanos são inicialmente diferenciados e propagados em frascos de cultura tecidual como agregados flutuantes livres de progenitores neurais, denominados EZ-spheres. O canal superior do Chip-S116,18,19 é semeado com esferas de EZ dissociadas que formam o “lado cerebral” do chip, pois as células se diferenciam ao longo de 7 dias em uma cultura mista de células progenitoras neurais (iNPCs), iAstrocitos e iNeurons. Os iPSCs humanos também são diferenciados em placas de cultura tecidual em iBMECs. O canal inferior do chip é semeado com iBMECs para formar o “lado sanguíneo” à medida que se desenvolvem para formar um tubo endotelial(Figura 1). A membrana porosa extracelular (ECM) revestida que separa os canais superior e inferior 1) permite a formação de interações celular-celular entre canais e 2) permite que o usuário execute ensaios de permeabilidade e células de imagem em ambos os canais usando um microscópio de luz convencional.
Protocol
Representative Results
Discussion
A combinação de tecnologia organ-on-chip e células derivadas do IPSC no NVU mantém a promessa de modelagem precisa do BBB humano. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para aplicação simples e robusta do recém-publicado chip BBB16. Uma visão geral e um tempo do paradigma de semeade é mostrado na Figura 3. Para obter e manter funções de barreira adequadas para a modelagem BBB, gerar uma monocamada homogênea do iBMEC e manter sua integridade são fundament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pela Fundação israelista de Ciência1 1621/18, pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST), Israel 3-15647, pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia, o ID DISC1-08800, a Sherman Family Foundation, nih-NINDS grant 1UG3NS105703, e a Associação ALS conceder 18-SI-389. AH foi financiada pela Wallenberg Foundation (grant number 2015.0178).
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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