Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion
Summary
Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.
Abstract
Gliomen zijn primaire hersentumoren gekenmerkt door hun invasieve en heterogeniteit. Specifieke histologische patronen zoals pseudopalissades, microvasculaire proliferatie, mesenchymale transformatie en necrose karakteriseren de histologische heterogeniteit van hoogwaardige gliomen. Ons laboratorium heeft aangetoond dat de aanwezigheid van hoge dichtheden van mesenchymale cellen, genaamd oncostreams, correleren met tumor maligniteit. We hebben een unieke aanpak ontwikkeld om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de groei en invasie van glioom. Hier beschrijven we een uitgebreid protocol dat gebruik maakt van laser capture microdissectie (LMD) en RNA sequencing om differentiële mRNA-expressie van intratumorale heterogene meercellige structuren (d.w.z. mesenchymale gebieden of gebieden van tumorinvasie) te analyseren. Deze methode handhaaft goede weefselhistologie en RNA integriteit. Perfusie, bevriezing, inbedding, doorsnede en kleuring werden geoptimaliseerd om morfologie te behouden en hoogwaardige lasermicrodissectiemonsters te verkrijgen. De resultaten geven aan dat perfusie van glioom dragende muizen met behulp van 30% sacharose een goede morfologie en RNA-kwaliteit biedt. Bovendien, kleuring tumor secties met 4% Cresyl violet en 0,5% eosine resulteert in een goede nucleaire en cellulaire kleuring, met behoud van RNA integriteit. De beschreven methode is gevoelig en zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt om tumormorfologie te bestuderen in verschillende tumormodellen. Samengevat beschrijven we een complete methode om LMD uit te voeren die morfologie en RNA-kwaliteit behoudt voor sequencing om de moleculaire kenmerken van heterogene meercellige structuren binnen vaste tumoren te bestuderen.
Introduction
Gliomen zijn de meest agressieve primaire tumoren van het centrale zenuwstelsel. Ze zijn zeer invasief en heterogeen1. Analyse van cellulaire en moleculaire componenten van de tumor zal nieuwe therapeutische doelen onthullen.
Onder verschillende methoden die momenteel beschikbaar zijn, laser capture microdissectie (LMD) van bevroren hersentumor weefsel is een kosteneffectieve, betrouwbare techniek die het mogelijk maakt de isolatie van discrete anatomische gebieden of specifieke celpopulaties van tumorweefsels om hun moleculairprofiel te bestuderen2,3. LMD maakt de analyse van mRNA-genexpressieprofielen van geselecteerde enkele cellen of meercellige structuren4,5. LMD kan worden gebruikt om diepgaande mechanistische kennis op te doen over de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens tumorprogressie. Verbetering in de verwerking van tumorweefsels is noodzakelijk om een optimale optische resolutie van weefselmorfologie en RNA-kwaliteit te verkrijgen6. Hoewel paraformaldehyde fixatie de beste optie is voor morfologische analyse, wordt de RNA-kwaliteit onder deze omstandigheden aangetast en afgebroken, wat resulteert in een slechte RNA-kwaliteit voor RNA-seq-analyse. Het gebruik van bevroren weefselsecties vermijdt ijskristalvorming, die celmembranen kan breken en gaten in cellen kan produceren, en blijft de beste optie voor RNA-Seq analyse7.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sectie fixatie en kleuring methode om bevroren muis hersentumor weefsels voor LMD te verwerken. Om te voorkomen dat ijskristallen zich in het weefsel vormen, hebben we muizen geperfundeerd met een oplossing van 30% sacharose. Deze oplossing verstoort de interacties tussen polaire watermoleculen en voorkomt de vorming van ijskristallen, waardoor de weefselmorfologie behouden blijft. Weefselkleuring is noodzakelijk om specifieke populaties cellen of anatomisch verschillende gebieden binnen de tumor te onderscheiden en te verkrijgen. Het is essentieel om het weefsel te fixeren en te bevlekken met onschadelijke kleurstoffen om de RNA-integriteit te behouden. Eerder is aangetoond dat kleurweefsel met hematoxyline/eosine (H&E) de RNA-integriteitverslechtert 8. We vasten en bevlekten het weefsel van belang met ethanol, Cresyl violet 4% en eosiny Y 0,5% oplossingen. Cresylviolet is een acidophilic kleurstof die vlekken de celkern met een donkerblauwe kleur. Eosiny Y is een basophilic kleurstof die vlekken basiscomponenten van de cellen, waardoor een onderscheid tussen cytoplasma en andere cellulaire structuren8. Beide kleurstoffen zijn oplosbaar in ethanol en verslechteren de RNA-kwaliteit niet. Om weefselschade te voorkomen en een hoge optische resolutie van de cellulaire structuren te behouden, hebben we de weefselsecties voorafgaand aan LMD9gemonteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan glioom heterogeniteit en invasie zijn van cruciaal belang om nieuwe therapeutische doelen bloot te leggen13. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerde en geoptimaliseerde methode om het moleculaire landschap van glioom heterogeniteit en invasie te analyseren met behulp van lasercapture microdissectie (LMD), gevolgd door transcriptieanalyse.
Laser capture microdissectie (LMD) kan worden gebruikt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door national institutes of health, (NIH/NINDS) Subsidies: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 naar M.G.C.; (NIH/NINDS) Subsidies R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 aan P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; het Department of Neurosurgery, Rogel Cancer Center aan de Universiteit van Michigan, ChadTough Foundation, en Leah’s Happy Hearts Foundation naar M.G.C. en P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 aan M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 voor Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) grant, Project F049768 aan A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, een Physician-Scientist Award van Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), grant R01 EY022633 from the NEI of the NIH (AK), and a unrestricted grant from RPB to the Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Dit onderzoek maakte gebruik van de Vision Research Core (P30 EY007003) en de Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK wordt ondersteund door de Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award van het A. Alfred Taubman Medical Research Institute.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
