Taşınabilir QPCR Sistemi ile Matricaria chamomilla Alan Tanımlama

Summary

Burada sunulan taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak Matricaria chamomilla alan tanımlama için bir protokoldür. Bu kolay gerçeklene kadar yapılan protokol, çiftlikler ve depolar gibi laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu yerlerdeki bir botanik türün kimliğini doğrulamak için ideal bir yöntemdir.

Abstract

Botanik ürünlerde kalite kontrol hammadde temini ile başlar. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme ve kimyasal analitik yöntemlerle gerçekleştirilir. Ancak, özellikle son yıllarda botanikçilerin kullanılabilirliği eksikliği, artan tüketici talebi ve iklim değişikliğinin getirdiği tedarik zinciri üzerindeki streslerle mücadele etmek için kalite kontrolünü artırma ihtiyacı ile birleştiğinde, alternatif yaklaşımlar gerektirmektedir. Bu protokolün amacı, laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu sahada veya herhangi bir ortamda taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak botanik türlerinin tanımlanmasını kolaylaştırmaktır. Hedef DNA boya bazlı qPCR kullanılarak yükseltilir ve DNA pozitif kontrol görevi görehizmet eden botanik referans malzemelerden elde edilir. Hedef DNA, spesifik amplifikasyon ulabilmekte ve erime tepesini pozitif kontrolle eşleştirerek tanımlanır. Okuyucuların bu protokolü kopyalayabilmesini sağlamak için, uygulamalı alan örnek koleksiyonundan DNA çıkarma, PCR amplifikasyonve ardından veri yorumuna kadar adım ve parametrelerin ayrıntılı bir açıklaması eklenmiştir. Üretilen sonuçlar geleneksel laboratuvar botanik tanımlama yöntemleri ile uyumlu. Protokolün gerçekleştirilmesi kolay ve uygun maliyetlidir ve hammaddeler üzerinde tedarik zincirinin çıkış noktasına mümkün olduğunca yakın kalite testi sağlar.

Introduction

Sağlık korumak ve iyileştirmek için botanik kullanma uygulaması binlerce yıl öncesine dayanıyor. Artan tüketici^talebi1 getirdiği tedarik zinciri üzerinde stresler nedeniyle , sürdürülemez hasat uygulamaları ve iklim değişikliği², botanik zina gıda ve diyet takviyesi sanayi³büyüyen bir endişe haline gelmektedir . Bildirilmemiş veya yanlış tanımlanmış botanik türlerinin varlığı etkinliğin azalmasına, hatta güvenlik sorunlarına yol açabilir. Örneğin, karayılan(Actaea racemosa),premenstrüel rahatsızlık tedavisinde kullanılan, etkinliği için sınırlı klinik veri desteği ile düşük fiyatlı Asya türleri ile değiştirilebilir⁴. Daha ciddi bir durumda, Çin otlar kullanarak kilo kaybı için bir klinik çalışmada Stephania terandra için Aristolochia fangchi ikame bazı katılımcılarda şiddetli nefrotoksisite ve böbrek yetmezliğine yol açtı^5,6. İki farklı tür, Çin’in ortak adı “Fang Ji”yi paylaşıyordu. Bu durumlarda daha sıkı kalite kontrolü için ihtiyaç vurgulamak, hammadde belirlenmesi ile başlayan⁷, tercihen mümkün olduğunca tedarik zincirinin başlangıç noktasına yakın, böylece kaynaklar verimli bir şekilde doğru kimlik malzeme tahsis edilebilir.

Botanik tanımlama için bir dizi ortogonal yaklaşım kullanılabilir. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme^8,9 ve kimyasal analitik yöntemler¹⁰,^11,,12,13ile gerçekleştirilir. Morfolojik tanımlama, bitki materyallerinin makroskopik ve mikroskobik özelliklerindeki farklılıklara dayanmaktadır (Şekil 1). Ancak, son yıllarda klasik botanik eğitim programlarının eksikliği uzman sıkıntısı neden oldu¹⁴, rutin kalite kontrolü için bu yaklaşımı pratik hale. Toz botanik malzemelerde uygulanması da sınırlıdır. Farmakope ve laboratuvarlarda kimyasal analitik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografisi (HPTLC), Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ve Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (Şekil2)gibi enstrümanların büyüklüğü nedeniyle saha testleri için ideal değildir. Son zamanlarda, genomik yöntemler botanik türlerin kimlik doğrulama ve ikame algılama için alternatif bir teknik olarak ortaya çıkmıştır ve verimli ve hassas olduğu kanıtlanmıştır. Genomik yöntemler bitki materyallerinde genetik bilginin yüksek sadakat ve özgüllüğünü kullanır^15,16,17,^18,,19. Moleküler tanı araçları taşınabilir cihazlar şeklinde mevcuttur, ve genellikle teknoloji kullanımı için engeli düşürmek otomatik veri yorumlama araçları içerir, alan tanımlama için ideal bu yaklaşım yapma^{20,21,22,23,24}. Moleküler analiz yöntemi²⁵,^26,,27olarak tasarlanmış ve doğrulandıktan sonra, temel moleküler biyoloji eğitimi almış herhangi bir personel tarafından yapılabilir. Mevcut farklı taşınabilir araçlar arasında, DNA dizileri üzerinde gerçek zamanlı PCR maliyet-etkin seçeneklerden biridir²⁸. Taşınabilir bir cihazın birleşimi, özelleştirilmiş ve doğrulanmış moleküler analizle birlikte, laboratuvar dışında, çiftlikler ve botanik malzeme depoları gibi botanik türlerinin ve malzemelerin doğrulanmasına olanak sağlar ve geleneksel yöntemlerle ilişkili zaman ve maliyetleri azaltır.

Bu protokolün amacı, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı veya kullanılamadığı durumlarda botanik tanımlama yöntemi ni tanıtmaktır. Yöntem Matricaria papatya bir alanda gösterilmiştir (Şekil 3A), yaygın Olarak bilinen Alman papatya, yaygın anti-inflamatuar ve antioksidan özellikleri için kullanılan²⁹. Özellikle Chamaemelumcinsi, Tanacetumve Krizantem^30,31^,32′den benzer görünüm veya kokunun ilgili türleri ile karıştırılabilir.³¹ İlgili türler arasında, Chamaemelum nobile, Ayrıca Roma papatya olarak bilinen, ticaret karşılaştırılabilir üretim düzeyleri ile fark edilir biridir (Şekil 3B). Gösterilen yöntem sadece hedef botanik türleri M. papatyatanımlamak için tasarlanmıştır , ama aynı zamanda yakın akrabası tespit, C. nobile, DNA dizilerinin belirli amplifikasyon dayalı.

Bu makalede, taşınabilir bir cihazda intercalating boya tabanlı qPCR ve erime eğrisi analizi kullanarak M. papatya alan botanik tanımlama nasıl gerçekleştirilecektir, ayrıntılı olarak açıklar. Protokol, sahadan botanik numunelerin toplanmasını, yerinde DNA çıkarılmasını ve gerçek zamanlı PCR reaksiyonunun ayarlanmasını içerir. Geçerli bir sonuç sağlamak için, hedef botanik M. papatya ve non-target botanik C. nobile genomik DNA, önceden sertifikalı botanik referans malzemelerden çıkarılan, pozitif kontrol olarak kullanılır. Bu yöntemin özgüllüğü hem M. papatya hem de C. nobile tanımlama testlerinin numuneler ve kontroller üzerinde ayrı ayrı gerçekleştirilmesi ile gösterilmiştir. PCR kontaminasyonundan kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları dışlamak için şablon dışı negatif denetim kullanılır.

Protocol

1. Örnek toplama Düz ve yatay bir yüzeye sahip bir test alanı ayarlayın. Papatya çiçeği alanındaki bitkilerin çoğunluğunun özelliklerini yansıtan temsili bir bitki tanımlayın(Şekil 4). Steril eldiven kullanarak temsili bitki bir çiçek kafası seçin. Numuneyi 2,0 mL toplama tüpüne yerleştirin. 1,3 ila 1,4 adımlarını tekrarlayın ve aynı bitkiden bir broşür (yaklaşık 0,5-0,7 cm uzunluğunda) toplayın.NOT: M. papatya çiçeği ve yaprağı 2.0 mL toplama tüpünün altında oturacak kadar küçüktür. Daha geniş yüzey alanına sahip diğer botanikler için, bir kağıt zımba veya makas (kullanmadan önce% 70 etanol içinde durulanır) test için doku örnekleri izole etmek için kullanılabilir. Birden fazla örnekleme gerektiğinde, farklı numunelerin işlenmesi arasında kağıt zımbaveya makas durulayın. 2. DNA çıkarma Kuru banyo kuluçka makinesini 95 °C’ye önceden ısıtın. Her toplama tüpüne, bitki DNA ekstraksiyon kitinden 100 μL çıkarma çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu’ndalistelenmiştir). Daha iyi DNA ekstraksiyon verimliliği için, bir doku pestle kullanarak ekstraksiyon çözeltisi doku örneği eziyet. Tüpü kapatın. Botanik doku çıkarma işlemi boyunca ekstraksiyon çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun. Toplama tüplerini önceden ısıtılmış kuru banyo kuluçka makinesine yerleştirin ve toplama tüplerini 95 °C’de 10 dakika kuluçkaya yatırın. 10 dakika sonra, kuru banyo kuluçka tüpleri dışarı atın. Aynı DNA çıkarma kitinden 100 μL seyreltme çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak karıştırın. Broşür çıkarma için aynı adımı tekrarlayın. Çözeltiyi daha fazla karıştırmak için sallayın. Bitki dokusu genellikle bu tedaviden sonra bozulmuş görünmüyor. Sıvı rengi değişebilir ve bulutlu olabilir.NOT: Seyreltilmiş çözelti hemen devam etmiyorsa oda sıcaklığında bir gecede saklanabilir. Depolamadan önce hücreli enkazı bitki dokusundan çıkarmak gerekli değildir. Tüplerdeki sıvı, pcr amplifikasyonu için DNA şablonlarını tutar. 3. PCR reaksiyon kurulumu QPCR alet termobisiklet koşullarını üreticinin özelliklerine göre yapılandırın. PcR termobisiklet profilini ilk denatürasyon için sabit bir sıcaklık adımı ilebaşlayan,ardından 25 döngü amplifikasyon ile başlayan ve yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi elde etmek için sıcaklık rampasıyla sona eren PCR termobisiklet profilini uygulayın. QPCR Master Mix ve astarları(Tablo 2)kullanmadan önce oda sıcaklığında eritin. Her kuyuya yüklenecek reaksiyonu planlayın: Hedef türlerle pozitif kontrol içeren kuyular, hedef olmayan türlerle pozitif kontrol, örnekler ve negatif kontrol(Şekil 5). Bu örnekte, on kuyu kullanılır – Alman papatya tanımlama testi için beş, Roma papatya tanımlama testi için kalan beş kuyu. Her tür tanımlama testi için, bir kuyu hedeflenen türlerin referans materyalinden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, bir kuyu hedeflenmemiş türlerin referans materyalinden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, iki kuyu tarladan çıkarılan çiçek ve yaprak DNA örnekleri ile doldurulur ve bir kuyu negatif kontrol için ayrılmıştır. Tablo 3 her kuyu türünü açıklar. Her botanik tür tanımlama testi için kılavuza göre bir reaksiyon master-mix hazırlayın. Tipik bir reaksiyon master-mix evrensel qPCR Master Mix (2x), ileri ve ters türlere özgü astarlar ve nükleaz içermeyen su içerir. Tablo 4 reaksiyon sistemi kompozisyonu listeler.NOT: Hemen kullanmıyorsanız, qPCR reaksiyon ana karışımını +2 °C ile +8 °C arasında bir soğutucuda veya mini buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce pipetleme ile reaksiyon ana karışımını iyice karıştırın. QPCR kartuşunu düz ve sabit bir yüzeye yüz üstü yerleştirin. Adım 3.4’te yapılandırılan reaksiyon master karışımının 18 μL’sini, 3.3’te tanımlanan kuyulara göre kartuş kuyularına yükleyin. Bu gösteri için, GC testi (GCT kuyu1, 3, 5, 7, 9) ve Roma papatya kimlik testi reaksiyon ana karışımı için etiketlenmiş kuyular içine Alman papatya kimlik testi test reaksiyonu ana karışımı ekleyin RC testi için etiketli kuyular içine (RCT kuyu2, 4, 6, 8, 10) (Şekil 5bakınız). DNA ekstraksiyon tüplerinin süpernatantından 2 μL’lik örnek DNA’yı ve önceden çıkarılmış DNA pozitif kontrollerini qPCR ana karışımı ile önceden yüklenmiş kartuş kuyularına aktarın. QPCR ana karışımına her DNA şablonu ekledikten sonra, çözeltiyi pipetleme ile hafifçe karıştırın.NOT: DNA çıkarma tüpünden DNA aktarırken yüzen hücresel enkazdan kaçının. Gerekirse supernatant ve hücresel enkaz ayırmak için minicentrifuge kullanın. Kartuşunu yapışkan filmle dikkatlice kapatın. Kartuşu termobisiklet odasına yükleyin ve kapatın. QPCR aracını çalışacak şekilde ayarlayın.

Representative Results

Bölüm 1’de açıklanan protokolün ardından, 95 °C’de 10 dakika boyunca toplama tüpünün ısı kuluçkasından sonra çiçek başı ve yapraktan botanik DNA’sı süpernatant içine çıkarıldı. Mevcut çalışmada, supernatant hem çiçek hem de yaprak için sarı ve yeşilimsi bir renk gösterdi, doğal bileşiklerçeşitli botanik DNA ile supernatant içine serbest olduğunu belirten(Şekil 6). Güvenilir PCR amplifikasyon daha sonra tüm alan çıkarılan DNA şablonu için triplicate elde edilmiş olsa da, DNA kalite değerlendirmesi referans olarak laboratuvarda yapıldı. Florürler tarafından belirlenen çiçek başı DNA ekstresinin konsantrasyonu 3.69-5.36 ng/μL arasında değişirken, yaprak DNA ekstresinin konsantrasyonu 6.42-9.29 ng/μL arasında değişmektedir. A260/A280 ve A260/A230 çiçek ve yaprak DNA özleri emicilik oranları spektrofotometri ile ölçüldü. Ancak, DNA ve fitokimyasal UV emilim spektrumu arasındaki örtüşme nedeniyle, bu oranlar güvenilirlik ölçüldü (veriler gösterilmedi). Hedef parçaların gerçek zamanlı olarak amplifikasyonunun izlenmesi için floresan boyanın ara sıra kullanılması. Hem özel astarlar M. papatya ve C. nobile hedef iç transkripsiyonlu spacer 2 (ITS2) bölge, hangi bitki genomu yüzlerce kopya onlarca vardır, 25 PCR amplifikasyon döngüleri papatya türlerinin belirlenmesi için yeterli amplicons oluşturmak için yeterlidir. Şekil7’de, M. papatya tanımlama testinde M. papatya pozitif kontrolü için Ct değeri 25 ‘ten (GCP_GCT) az iken, 25 amplifikasyon döngüsünden sonra, C. nobile tanımlama testinde aynı kontrolün floresansı tespit eşiğinin altındaydı (GCP_RCT). Öte yandan, 25 döngüden sonra, M. papatya tanımlama testinde C. nobile pozitif kontrolü için floresan algılama eşiğinin (RCP_GCT) altında iken, C. nobile tanımlama testinde aynı kontrol için Ct değeri 25 ‘ten (RCP_RCT) daha azdı. Kendi tahlillerinde hedef ve hedef olmayan pozitif kontrollerin amplifikasyonu, M. papatya tanımlama testinin özgüllüğünü göstermektedir. Örnek DNA için, alan çiçek kafası ve yaprak DNA ekstresi, M. papatya tanımlama testinde sırasıyla (Sample1(FLOWER)_GCT ve Sample2(LEAF)_GCT) 15.18 ve 19.41 Ct değerleri vermiştir. Bu örneklerin her ikisi de C. nobile tanımlama testinde (Sample1(FLOWER)_RCT ve Sample2(LEAF)_RCT) olarak yükseltilmedi. Her iki numunenin amplifikasyon desenleri M. papatya pozitif kontrolün amplifikasyon deseniile eşleşti. PCR kontaminasyonunneden olduğu yanlış pozitifler olasılığı dışında hem M. papatya hem de C. nobile tanımlama testlerinde (NC_GCT ve NC_RCT) negatif kontroller güçlendirilmedi. Pozitif kontrolve numunelerde spesifik amplifikasyonu doğrulamak için, her kuyudan PCR son ürün fraksiyonları laboratuvarda %2 agarose jel üzerinde çalıştırıldı(Şekil 8). M. papatya tanımlama testi için, her iki saha numunesi de M. papatya pozitif kontrolü ile aynı pozisyonda çalışan ve tahmini boyutu 100 bp’nin biraz üzerinde (teorik boyut 102 bp) amlikon verdi. C. nobile tanımlama testi için, hedef olmayan türler C. nobile pozitif kontrol 50 ve 100 bp arasında bir bant, 65 bp teorik boyutu uygun bir bant verdi. Şeritlerin geri kalanı, saha testlerinde gözlendiği gibi, bu kuyular için floresan sinyal yokluğu ile aynı fikirde olan özel bir amplifikasyon ürünü göstermedi. PCR amplifikasyonundan sonra, ısıtma sırasında çift iplikli DNA’nın (dsDNA) dissosifikasyon özelliklerini değerlendirmek için bir erime eğrisi analizi yapıldı. Erime eğrisi analizi için son döngü sırasında sıcaklık arttıkça, sıcaklıktaki artışlar çift iplikli amperlerin ayrışmasını neden oldu. Ara floresan boya yavaş yavaş çözeltiiçine salındı, floresan yoğunluğu azalan (Şekil 9A). İlk türev eğrinin çekim noktası, esas olarak DNA parça uzunluğuna ve GC içeriğine bağlı olan erime sıcaklığını (Şekil9B)belirlemek için kullanılmıştır. Ct değerinin erime sıcaklığı ile birleştirilmesi qPCR analizinin özgüllüğünü artırabilir. Bu çalışmada, M. papatya pozitif kontrol PCR amplicon erime sıcaklığı zirve oluştu 85.6 °C (GCP_GCT) ve 79.1 °C (RCP_RCT) de C. nobile pozitif kontrol PCR amplicon erime sıcaklığı zirvesinden farklıydı. Alan çiçeği kafası ve yaprağındaki PCR amplicon sırasıyla 85.2 °C ve 84.8 °C’de erime sıcaklık zirveleri üretti (Sample1(FLOWER)_GCT ve Sample2(LEAF)_GCT). Taşınabilir qPCR sistemi ile ölçülen erime sıcaklığı değişimlerini değerlendirmek için, numune erime sıcaklıklarının M. papatya pozitif kontrolünden (2 °C içinde) elde edilen erime sıcaklığına her zaman yakın olduğunu ve C. nobile pozitif kontrol amperinin erime sıcaklığından çok uzak olduğunu doğrulamak için ek veri noktaları toplanmıştır (Şekil 10). Erime sıcaklık zirveleri bazen diğer kuyularda bildirilmiştir. Ancak, Ct değerleri 25’ten az değildi ve erime sıcaklık zirveleri M. papatya veya C. nobile pozitif kontrolüne yakın değildi (2 °C’den fazla ara). Özetle, alan M. papatya tanımlama testi Tablo 5’teözetlenen karar kurallarına göre yorumlanabilir. Tüm pozitif kontroller putatif botanik türleri için pozitif test, diğer türler için negatif ve negatif kontroller negatif test ile, her iki alan örnekleri M. papatya değil, C. nobileiçerdiği tespit edildi. Buna ek olarak, alan testi sonuçlarını diğer analitik tekniklerle hizalamak için, alan sonuçları daha önce onaylanmış bir DNA barkodlama yöntemi25 (veriler gösterilmemiştir) ile daha da doğrulandı. Şekil 1: Botanik malzemelerin morfolojik tanımlaması. (A) Hibiscus rosa-sinensis çiçekleri, Curcuma longa kökleri, Malva Sylvestris yaprakları, Rosmarinus officinalis yaprakları, Coriandrum sativum tohumları, Zingiber officinale kökleri. (B) Petroselinum crispum ve Apium graveolens pulları ayırt etmek zordur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Botanik malzemelerin kimyasal olarak tanımlanması. (A) HPTLC cihazı ve temsili bir HPTLC kromatogramı. (B) HPLC cihazı ve temsili hplc kromatogramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Matricaria chamomilla ve Chamaemelum nobile alanında. (A) Matricaria papatya, CC BY-SA 3.0 altında Wikipedia uyarlanmıştır, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, Wikipedia’dan CC BY-SA 3.0 altında uyarlanmıştır, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Tarladan M. papatya bitki parçaları toplama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Gösterideki test kuyularının düzeni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Toplama tüplerinde alan DNA ekstresi. Botanik doku orijinal tüp kalır ve sarımsı DNA ekstresi ile kaplıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: PCR ürünlerinin 25 döngü termobisiklet üzerinde birikmesini gösteren floresan çizimi. M. papatya pozitif kontrol ve C. nobile pozitif kontrol, Sırasıyla M. papatya ve C. nobile tanımlama testlerinde 25’ten az Ct değerleri göstermektedir. Tarla çiçeği ve yaprak örnekleri 15.18 ve 19.41 Tomografi değerleri ile M. papatya tanımlama testi ile güçlendirilmiştir. Kuyuların geri kalanı güçlendirilemedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Alan PCR amplifikasyon ürünlerinin jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Erime sıcaklık analizi. (A) Her kuyudaki floresan sinyali artan sıcaklıkla azalır. (B) PCR ürünlerinin kimliği erime eğrisi analizinde erime sıcaklığının zirvesi ile doğrulandı. Tarla çiçeği ve yaprak örnekleri 85.2 °C ve 84.8 °C’de zirveleri göstermektedir. Bu M. papatya pozitif kontrol tarafından üretilen tepeyakındır. C. nobile pozitif kontrolü 79.1 °C’de bir tepe üretti ve bu da diğer üç örnekten farklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: Erime sıcaklığı pozitif kontrol ve alan örnekleri arasındaki en yüksek değişimdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Sahne Döngüsü Sıcaklık Saat Sabit Sıcaklık 1 95 °C 60s Amplifikasyon 25 95 °C 30s 60 °C 30s Erime Eğrisi 1 60 °C Rampa 0.05 °C/s 95 °C Tablo 1: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için qPCR termobisiklet koşulları. Tahlil Astar adı Sıra 5′-3’ Konum Bölge Amplicon Boyutu Matricaria recutita ZL3 TCGTCGGTCGCAAGGATAAG Ileri ITS2 102 bp ZL4 TAAACTCAGCGGGTAGTCCC Ters Chamaemelum nobile ZL11 TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA Ileri ITS2 65 bp ZL12 TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC Ters Tablo 2: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için astar çiftleri. İyi pozisyon Peki adı Açıklama 1 GC_PosCtrl_GC_Test GC Testi kapsamında Alman papatya pozitif kontrolü 2 GC_PosCtrl_RC_Test RC Testi altında Alman papatya pozitif kontrolü 3 RC_PosCtrl_GC_Test GC Testi altında Roma papatya pozitif kontrolü 4 RC_PosCtrl_RC_Test RC Testi altında Roma papatya pozitif kontrolü 5 Field_Sample_GC_Test GC Testi altında yaprak dokusu örneği 6 Field_Sample_RC_Test RC Testi altında yaprak dokusu örneği 7 Field_Sample_GC_Test GC Testi altında çiçek dokusu örneği 8 Field_Sample_RC_Test RC Testi altında çiçek dokusu örneği 9 NegCtrl_GC_Test GC Testi kapsamında negatif kontrol örneği 10 NegCtrl_RC_Test RC Testi kapsamında negatif kontrol örneği Tablo 3: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için iyi tipler ve açıklamalar. Reaktif GC_Test RC_Test Evrensel qPCR Mix* 10 μL 10 μL ZL3 astar (10 μM) 0,4 μL Na ZL4 astar (10 μM) 0,4 μL Na ZL11 astar (10 μM) Na 0,4 μL ZL12 astar (10 μM) Na 0,4 μL H2O (Nükleaz içermez) 7.2 μL 7.2 μL * Sıcak Başlangıç Taq DNA Polimeraz içerir Tablo 4: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için master-mix kompozisyonu. Iyi Adı Beklenen Sonuç Pozitif Sonuç Kriterleri Negatif Sonuç Kriterleri Algılanan / Mevcut Algılanmadı / Yok GC_PosCtrl_GC_Test Algılandı Ct < 25 ve 84 <= Tm <= 86 – GC_PosCtrl_RC_Test Algılanmadı – 25 döngü içinde Ct değeri yok RC_PosCtrl_GC_Test Algılanmadı – 25 döngü içinde Ct değeri yok RC_PosCtrl_RC_Test Algılandı Ct < 25 ve 79 <= Tm <= 81 – Field_Sample_Leaf_GC_Test Mevcut Ct < 25 ve 84 <= Tm <= 86 25 döngü içinde Ct değeri yok Field_Sample_Leaf_RC_Test Yok – 25 döngü içinde Ct değeri yok Field_Sample_Flower_GC_Test Mevcut Ct < 25 ve 84 <= Tm <= 86 25 döngü içinde Ct değeri yok Field_Sample_Flower_RC_Test Yok – 25 döngü içinde Ct değeri yok NegCtrl_GC_Test Algılanmadı – 25 döngü içinde Ct değeri yok NegCtrl_RC_Test Algılanmadı – 25 döngü içinde Ct değeri yok Tablo 5: QPCR sonuç yorumu için kurallar.

Discussion

Astar tasarımı ve şablon seçimi verimli ve özel bir qPCR amplifikasyon elde etmek için önemli adımlardır. Uygun bir şablon belirledikten sonra, astar tasarım yazılımı genellikle astar uzunluğu, erime sıcaklığı ve GC içeriği^33,34gibi tasarım değişkenlerine dayalı astar seçimine yardımcı olmak için kullanılır. Optimizasyon ve doğrulama, PCR reaksiyonunun özgüllüğünü, hassasiyetini ve sağlamlığını sağlamak için tahminbeklenen deneysel koşulları altında gerçekleştirilebilir³⁵. Sub-optimal astar tasarımı astar-dimer oluşumuna neden olabilir, astar etkileşimleri spesifik olmayan ürünler üretmek ise³⁶.

Bu çalışmada kullanılan şablon denetimleri (NTC) hem DNA kontaminasyonu hem de testi etkileyebilecek astar-dimerlerin varlığını kontrol eder. Sonuçlar amplifikasyon göstermedi, hem DNA kontaminasyonu hem de astar-dimerlerin bir sorun olmadığının iyi bir göstergesi. DNA kontaminasyonu ve astar-dimerhiçbir şablon kontrolleri ile erime eğrileri tezahür ve pozitif kontrollerin erime eğrileri ekstra zirveleri olarak. Genellikle, şablondaki AT açısından zengin alt etki alanları düzensiz erimeye neden olmadıkça, pozitif kontrolün erime eğrisinin tek bir tepe içermesi beklenir. Çift zirveleri uMELT yazılımı³⁷kullanarak erime tahlilleri simüle ederek tahmin edilebilir. Bu çalışmada, hedef PCR ürününün varlığını ve kontaminasyon ve astar-dimer eksikliğini doğrulamak için AGAROSE jel üzerinde PCR ürün çalışan altın standart kullanılmıştır.

Botanik malzeme moleküler analizinde önemli bir sorun, botanik DNA çıkarma işleminden sonra kaliteli DNA elde etmektir. Botanik malzemeler ticareti ve sağlık yararları ile ilişkili aktif kimyasal bileşikler için tüketilen. DNA çıkarma sürecinde, bu kimyasal bileşikler de DNA çıkarma çözeltisi içine serbest bırakılacak, potansiyel PCR inhibisyonu neden, pcr amplifikasyon başarısızlıkları ile sonuçlanan. Çeşitli bitki DNA arıtma kitleri organik çözücüler ve sütunlar kullanarak botanik elde edilen kimyasal bileşikleri kaldırmak için geliştirilmiştir³⁸. Ancak, duman başlık ve yüksek hızlı santrifüj bu kitleri yardımcı olmak için gerekli alanında mevcut değildir.

Mevcut protokolde, basitleştirilmiş DNA çıkarma yöntemi ticari bir bitki DNA çıkarma kiti kullanır (ayrıntılar için Malzeme Tablosu’na bakınız). Bu tekrarlanabilir sonuçlar için ortak inhibitör maddeleri nötralize etme yeteneğine sahip ve M. papatya ve C. nobile için tutarlı sonuçlar üretti. Hem M. papatya ve C. nobile çiçek kafaları ve yaprakları belirli erime zirveleri ile PCR amplicons verdi, PCR inhibitörleri varlığı bir endişe olmadığını gösteren. PCR inhibitörleri daha yüksek düzeyde olan diğer tesisler için, orijinal ekstraksiyon DNA yükseltici daha az verimli olabilir. İnhibisyonu azaltmak ve amplifikasyon verimliliğini artırmak için, tüm tesise erişim ile, düşük polisakkarit ve polifenol içeriği ile diğer bitki parçaları da tanımlama amacıyla kullanılabilir. Farklı bitki parçaları sınırlı erişim varsa, genç yaprakları veya yaprakları çiçek başları, genellikle düşük fenolik içeriğe sahip kesilir³⁹, başarı daha iyi bir şans sunabilir. DNA dizileri tüm bitki boyunca tutarlı olduğundan, herhangi bir bitki parçası türlerin kimliğini doğrulamak için kullanılabilir. PCR amplifikasyonu hala yetersiz ise, orijinal DNA özü PCR’den önce daha da seyreltilebilir veya daha gelişmiş laboratuvar arıtma protokolleri kullanılabilir.

PCR analizi için bir diğer sorun dna kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar, hangi olumsuz veri yorumlanması etkileyebilir. Genellikle aktif temizlik, özel ekipman kullanarak ve belirlenen alanlarda iş kısıtlayan tarafından kontrol edilir. QPCR kullanılarak, tüm PCR analizi kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir, bu da iyi kontrol edilemeyen bir ortamda PCR amplicon kontaminasyonu olasılığını büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, çevresel DNA da bir önceki doğrulama çalışmasına göre, bir önceki doğrulama çalışmasına göre, töz özgüllüğü nedeniyle yanlış pozitif göstermemelidir⁴⁰.

İyileştirme için yer var. Burada sunulan protokolde, hedef parça amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak göstermek için ara boya kullanılmıştır. Yöntemin özgüllüğü, M. papatya ve C. nobile amfikonları arasında farklı olan karakteristik erime sıcaklığı ile daha da doğrulanır. Bu nedenle, boya bazlı PCR’nin ara sınıfa yansıtLanması, “Bu bitki türü nedir?” sorusuna verimli bir şekilde cevap verebilir. Ancak, tarladan izole edilmiş tek bir tesis üzerinde botanik tanımlama nın yanı sıra, birçok durumda, depodaki botanik tozlar veya ekstreler de yerinde hızlı kimlik değerlendirmesinden yararlanacaktır. Bu tür malzemeler için “Bu materyalde ne var?”, “Aradığım botanik türleri içeriyor mu?”, “Kaçınmak istediğim zina ları içeriyor mu?”, “Zararlı diğer botanik türler tarafından tamamen veya kısmen mi değiştiriliyor?” gibi ek soruların ele alınması gerekebilir. Farklı qPCR probları, bir reaksiyon sisteminde farklı botaniklerden gelen ampliconları hedef almak için tasarlanmış, aynı zamanda yüksek özgüllük ve verimi korumak için intercalating boya kullanmak yerine. Prob tabanlı qPCR’nin geliştirilmesi ve birden fazla kanal tespiti sunan taşınabilir bir qPCR sisteminin kullanımı, saha testinin amacı için uygun bir test olarak uygulanmasını, daha karmaşık soruları yanıtlamak için botanik malzeme depoları ve dağıtım merkezleri gibi daha geniş bir ortam ayarına genişletebilir. Buna ek olarak, birden fazla prob kullanarak da kullanıcı her reaksiyon sistemi dahilamplifikasyon dahil sağlar, böylece PCR inhibisyonu şüphelenildiğinde daha fazla bilgi kullanılabilir olacaktır.

Burada sunulan protokol, aynı amaçla kullanılan mevcut teknolojilere göre aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, geleneksel morfolojik ve kimyasal tanımlama yöntemleri için, prosedür ve sonuçları nın uzmanlar tarafından yürütülmesi ve yorumlanması gerekmektedir. qPCR tabanlı tanımlama testleri temel moleküler biyoloji eğitimi almış kişiler tarafından yapılabilir ve daha standart bir şekilde yorumlanabilir. İkinci olarak, normalde laboratuvarda gerçekleştirilen qPCR tabanlı tür tanımlama ve farklılaştırma ile karşılaştırıldığında, taşınabilir bir alet kullanarak alan tanımlama protokolü, yüksek hızlı santrifüj, DNA kalite değerlendirme ekipmanı, floresan dedektörlü termal çevrimci ve özel bir yazılım çalıştıran bilgisayar gibi büyük ayak izine sahip aletler gerektirmez. Böylece DNA tabanlı türlerin tanımlanması herhangi bir ortamda gecikmeden gerçekleştirilebilir. Üçüncü olarak, botanik malzeme aramak küresel bir işlem gerektiren bir görevdir. Bulut hizmetleri ve yapay zekadaki gelişmelerle, taşınabilir bir cihaz laboratuvardaki uzmanlar tarafından geliştirilen ve doğrulanan yöntemleri alabilir, uzak bölgelerde uzman olmayanlar tarafından çalıştırılabilir ve üçüncü taraflardan objektif sertifikalar üretebilir. Bu nedenle, bu seçenek her zamankinden daha uzak çalışma eğilim haline ile daha zorlayıcı.

Özetle, buradaki protokol, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanılarak M. papatyanın alan tanımlamasını göstermiştir. Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, botanik tanımlama konusunda son derece doğru sonuçlar üretecek ve botanik üreticilerinin ve tedarikçilerinin botanik malzemelerini zamanında ve uygun maliyetli bir şekilde nitelendirmelerinde yardımcı olacaktır.

Materials

Battery	TNE	78000mAh	Provide field power supply
bCUBE	HYRIS	bCUBE 2.0	Portable qPCR instrument
Cartridges(16 Well)	HYRIS	NA	Consumables for bCUBE
Electric pipette	Eppendorf	NA	Handling liquid
Extract-N-AmpTM plant PCR kit	SIGMA	XNAP2-1KT	Plant DNA extraction kit
German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials	AHP	2264	Used as positive control
Mini dry bath	Yooning	MiniH-100L	For DNA extraction
Nuclease-free water	AMBION	AM9937	qPCR reaction
Primer	Thermo Fisher Scientific	NA	qPCR reaction
Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials	ChromaDex	ASB-00030806-005	Used as positive control
Luna universal qPCR master mix	NEB	M3003L	qPCR reaction