Summary
我々は、ラットにおける異所性腹部心臓移植のモデルを記述し、現在の戦略の改変を暗示し、外科的アプローチを単純化する。さらに、重要な心筋細胞の耳内注射による新しい拒絶反応モデルを記述し、ラットにおける免疫学的分析をさらに可能にする。
Abstract
ラットにおける異所性心臓移植は、50年以上にわたり多様な免疫学的研究のために一般的に使用されてきたモデルである。1964年の最初の説明以来、いくつかの変更が報告されています。ラットで30年間異所性心臓移植を行った後、我々は簡単に教えられ、さらなる外科的訓練や背景なしで行うことができる簡単な外科的アプローチを開発しました。
上頂大動脈の解剖および肺動脈の解剖および上および下および下の静脈および肺静脈の結紮の後、ドナー心臓は収穫され、その後ヘパリンを補った氷冷生理食水溶液で浸透する。レシピエント腹部血管をクランプして切開した後、ドナーの上が大動脈と肺動脈は、連続的な走り縫合糸を使用して、それぞれレシピエント腹部大動脈および下大静脈に吻合される。
異なるドナーとレシピエントの組み合わせに応じて、このモデルは、同種移植片の急性または慢性拒絶反応の分析を可能にする。このモデルの免疫学的意義は、重要な心筋細胞の耳内注射と子宮頸部リンパ組織の排液のその後の分析の新しいアプローチによってさらに高められる。
Introduction
異所性心臓移植は、移植耐性、急性および慢性同種移植片拒絶、虚血再灌流傷害、機械灌流または心臓改造に関する様々な調査のために頻繁に使用される実験モデルである。他の利点の中で、移植機能は、触診および移植片の障害によって非侵襲的に監視することができ、腎臓または肝臓などの他の器官とは対照的に、レシピエントの重要な障害をもたさない。
1964年、Abbottらは当初ラット1における異所性腹部心臓移植について説明した。その後、1966年に、解剖学のためのエンドツーサイド技術は、Tomitaららによって記述されました。現在使用されているモデルの基礎は、1969年に小野とリンジーによって報告されました 3.過去数十年の間に、異種の異所性心臓肺移植4、5、6,6を含む、アンロードされた、部分的にロードされた、または積み込まれた左心室4の心臓移植片の異なるタイプを作成するためにいくつかの変更が公開されている。免疫学的分析では、非体積負荷の心臓移植移植が最も一般的に行われる。この場合、血流は逆行してドナーの大動脈を上昇し、その後冠状動脈に入る。静脈の排水は、冠動脈静脈内に沿って右心房と心室に入って起こる(図1A-B)。したがって、左心室は、テベシア静脈からの血液の限界量とは別に、血流から除外される。これはまた、左心室補助装置療法7の間に病態生理学的メカニズムを研究するための有用なモデルになる。
異所性心臓移植は、マウス、ウサギ、ブタを含む様々な種で行われ、,ヒト8、9、10、119のユニまたは自転車補助装置としても8使用されている。,1011ラットは移植モデルに対して依然として一般的な実験動物を表しており、特に異なるラット株の組み合わせに対する移植片生存時間が過去に明確に定義されており、多数の免疫学的試薬が12,13,13にアクセス可能であるためである。マウスとは異なり、ラットは、より大きな手術を行い、免疫学的分析のためのより現実的な12のためにリンパ組織へのアクセスを行う。さらに、近年ラットに商業的クローニング技術が導入されると、実験ラットモデル14に対する関心が再び高まる可能性が高い。
一般に、異所性心臓移植片は、子宮頸部または腹部吻当を行うことによって、レシピエント血管に結合することができる。しかし、いくつかの研究は、大腿骨吻合が手動触診または経胎児心エコー検査のためのより良いアクセスによる改善されたモニタリングを促進し、したがって、移植片の失敗15、16,16のより正確な検出を可能にすることを示唆している。
両方の吻合技術17の間に、手術時間、合併症率、転帰および移植片生存時間に関する相違がないことを示している。明らかに、十分な数のリンパ節の排出の可用性は、子宮頸部吻合の利点として言及されなければならない。ただし、より長いトレーニング期間が必要です。対照的に、腹部吻合は、特に同種心筋細胞の耳内注射とその後の子宮頸部リンパ管切除術の新しい方法の結果と組み合わせると、免疫学的調査のためにそれほど複雑ではなく、同様に価値がある。両方のモデルの組み合わせは、介入後の免疫学的分析の広いスペクトルを提供しています。
以下のプロトコルは、虚血時間を短縮するために外科医の対で動作することを指す。しかし、すべての実験は、単一の人が行うことができます。心臓の排泄および移植のための器具および材料のセットアップは図2A-Bに表示される。
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Protocol
すべての動物の経験は、承認ID12/0768と17/2472でニーダーザクセン州(LAVES、オルデンブルク、ドイツ)の消費者保護と食品安全のための地域当局の地元の倫理動物審査委員会のガイドラインに従って行われています。
1. 心臓の流出と灌流
注:移植片ドナーとして、7〜22週齢の雌または雄のラットが使用された。
- イソフルラン吸入(1 L/minのO2流量で5%、維持時に5%で誘導)することによりドナーラットを麻酔する。術周麻酔のための体重のkg当たりカルプロフェン5mgを皮下に注入し、つま先ピンチ離脱反射の欠如を確認する。
- 目の潤滑剤を塗布し、機械的なクリッパーを使用して腹部と胸部の毛皮を取り除きます。
- ドナーをスピービンの位置に置き、手術台の基部に弾性バンドで手足を固定し、70%エタノールまたは別の十分な代替手段で皮膚を殺菌する。
- 局所麻酔薬の塗布後、縦方向に皮膚を切開(例えば、リドカイン0.2%)はさみを使用して、中央値の腹腔切多を行います。
- レトラクタを挿入し、ドナーの左側に腸を動員し、下の静脈を殺菌綿棒で露出させる。
- 抗凝固の場合は、下の静脈を穿刺して1mLの氷冷等張生理食合液に溶解した500 I.U.のヘパリンを静脈内に注入する。針の引き込み後に綿棒で光圧縮することにより穿刺部位での出血を止める(図3A)。
- 横隔膜を切開し、ドナーの両側に側部開切術を行う。
- 胸郭の動員された腹側壁を操作テーブルにピン留めします。
- 2つのマイクロニードルホルダーを使用して鈍い調製によって心膜と迷走神経を取り除きます。
- ドナーを外装し、心臓をアンロードするために腹部血管の切除を行う。
- プローブ尖ったはさみの鈍い枝を心膜静脈内に挿入し、濡れた圧縮で心臓の軽い尾側の牽引の下で可能な限り遠位に上昇大動脈と肺動脈を分離する(図3B)。
- 上方静脈と下静脈と肺静脈の周りに単一の5-0合字を配置し、可能な限り後ろ向きに締めます(図3C)。
- 組織の裏を合字に切断し、心臓を抽出する(図3D)。
- 静脈内カテーテルから上昇大動脈を通る18Gカニューレと、30mLの氷冷、アイソトン生理食音溶液を1000 I.U.のヘパリンで補い、氷の上に生理食音溶液で満たされた15mLの心臓を入れる(図E-F)。
2. 心臓移植
注:レシピエントとして、10〜14週齢の雌または雄のラットが使用された。ドナーとレシピエントはほぼ体重が一致した。
- イソフルラン吸入(5%で誘導し、1L/minのO2流で1.5〜2%で維持)を用いてレシピエントラットの麻酔を行う。術周麻酔のための体重のkg当たりカルプロフェン5mgを皮下に注入し、つま先ピンチ離脱反射の欠如を確認する。
- 目の潤滑剤を塗布し、腹部の毛皮を取り除き、手足を固定し、ドナーの準備に類似して皮膚を殺菌する。最適な術後の結果を得るために、加熱マット上で手術を行い、術中低体温症を防止します。
- 皮膚の縦切開後、腹筋膜にリドカイン(0.2%)などの局所麻酔薬を塗布する。開腹手術の中央値で腹腔を開き、リトラクタを挿入します。
- 腸をレシピエントの左上側に動員し、湿潤した湿潤で入れる。
- 十二指腸と近位性の全角を動員した後、5-7倍の拡大で手術顕微鏡(または虫眼鏡)を用いて、綿棒で鈍い調製により腹部大動脈と下の大静脈を露出させる。腹部の血管を分離しないでください。
- 腰部静脈を傷つけずに2つのマイクロ針ホルダーを使用して腹部を高め、クーリー血管クランプを配置します(図4A)。
- 30~45°アーチ型27Gカニューレで腹部を穿刺する(図4B)。
- ポッツはさみを使用して穿刺部位を拡大し、ドナー容器の内腔の大きさに合った縦切開を作成し(図4C-D)、血栓を除去し術後血栓症を予防するためにレシピエント血管に生理液を浸透させます。
- 移植片を座地に置き、ドナーの大動脈を受け得られた腹部大動脈に2つの簡単な中断されたステッチで固定する(8-0縦切開の頭蓋および尾角角におけるモノフィラメント非再配置可能縫合糸(図4E)。
- 8-0で走る受け取り側の腹部大動脈を有するドナーの上昇大動脈を吻合するモノフィラメント縫合は2つのステップで:まず、移植片をレシピエント血管の右側に置き、吻合の前半を行う(図4E)。続いて、移植片をレシピエント血管の左側に置き、吻膜の後半を行う(図4F)。
- ドナー肺動脈を大動脈吻病に類似した下静脈に固定する(8-0モノフィラメント非再ソーブル縫合糸)。血管の内反体側からの静脈吻合の前半を縫合する(図4G-H)。
- 末梢塞栓症を防ぐために結び目を締める前に、生理的な人を直接洗い流してください。
- 両方のアナストモーゼの周りに止血性ガーゼを置き、移植片の再灌流が始まるようにクーリー血管クランプを慎重に放出します。滅菌綿棒で軽い圧縮によってアナストモーゼに沿って出血を処理する。
注:移植片は約60のsの後に叩き始めるはずです。 - 方法のような蛇行で腸を交換してください。腸壊死や機械的閉塞を防ぐために、腸間膜基数のマル回転がないことを確認してください。
- 連続した3-0ポリフィラメントの縫合線を使用して、腹筋/筋膜と皮膚を別々に閉じます。
3. 術後ケア
- 術後鎮痛の場合、術後1日(POD)の体重1kg当たりカルプロフェン5mgの追加皮下注射をレシピエントに供給する。さらに, 3番目のPODまで飲料水の500 mLにメタミゾールの1 gを追加します。.
- 第3PODで毎日腹部触診によって心臓移植機能のモニタリングを開始する。
注:第3POD前に移植片が失敗した場合、免疫不全ではなく外科的障害を考慮する必要があります。しかし、これはもちろん、選択された株の組み合わせとそれぞれの免疫学的モデル(例えば、事前免疫後の超急性拒絶反応)に依存する。 - 移植片拒絶反応後、麻酔筋の頭蓋の後腹膜リンパ節の排出のような組織を抽出し、脾臓、血液、胸腺および移植片をフローサイトメトリーまたは免疫組織化学を介して更なる免疫学的分析を行う。
4. 心の酵素消化と耳の心臓細胞の皮下注射
- 異所性心臓移植に類似した心臓の排泄および灌流を行う(ステップ1参照)。
- 無菌メスまたは滅菌ハサミを使用して心臓を3mm x 3mmブロックに細断し、0.5mg/mLコラゲナーゼを含む培地中で37°Cで30分間インキュベートします。
注:特にFCSはコラゲラーゼ消化を阻害するので、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンを含む培養培地を胎児子牛血清(FCS)なしで使用することが重要です。 - 消化された組織を大きな毛穴のふるいに加えながら、培養培地を取り除き、ミンチを十分にミンチして重要な心臓筋細胞、主に死んだ単一心細胞および残りの血液細胞の懸濁液を得る。細胞懸濁液を滅菌等張生理的な生理液で2回洗浄します。
注意:遠心分離設定:10分、200 x g、20°C - 40 μmのセルストレーナーを使用して懸濁液をフィルターし、5-10 mLの等張生理的生理液で細胞ストレーナーを洗い流して、重要な細胞コンゲリーを収集します。
- 遠心分離後、5x105細胞/mLの濃度で溶解した生理食音溶液中の心筋細胞を再中断し、細胞溶液を1mLシリンジに引き上げる。
- 異所性心臓移植のために、レシピエントナルコシス(ステップ2を参照)について説明したプロトコルに類似した麻酔を行う。
- 受信者を横向きの位置に置き、両面テープを使用して指で耳を固定します(図5A)。
- 27 G カニューレs.c.近くから心臓筋細胞溶液の 20 μL (1x 104細胞を含む) を、視覚キャピラリー血管の近くからレシピエントの耳に注入する (図 5B)。
- 定義された観察期間の後(選択した株の組み合わせと拒絶反応の強さに応じて)、排液子宮頸部リンパ節を抽出し、フローサイトメトリーまたは共培養などのさらなる分析を行う(図5C)。
注:さらに、細胞の浸潤を決定するために、ピナの組織学的分析を行うことができます。
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Representative Results
これまで、異なる免疫学的問題は、95%以上の生存率を持つ500以上の移植によって作業群で検証されたモデルに基づいて対処されてきました13,18,,19,,20,,21,,22,,23, 24.,24総手術時間(移植片の排泄および移植を含む)は通常60分を超えなかったのに対し、寒さと暖かい虚血時間を合わせたのは約30分であった。適用されるひずみの組み合わせは、主にルイス(Lew)の背景に基づいていました。シンジェニック移植は、移植片の故障の徴候なしに最大100日間生存したが、移植片の排泄物の場合には有意な重量およびサイズの減少であった。最近では、高速および長期拒絶モデルをシミュレートする2つの異なるドナーとレシピエントの組み合わせで異所性心臓移植を行いました:Lew.1a → Lew wtは高速拒絶反応(平均生存時間7.4日)とLew.1uの平均拒絶反応(平均生存時間42.5日)につながりました( 図6)。マクロスコープでは、拒絶された移植片は生き生きとした変色および腫脹を伴う血栓症を示したのに対し、非拒絶移植片は、アンロードされた左心室の結果として最も可能性が高い明確な萎縮を示す。さらに、アルカリホスファターゼ-抗アルカターゼ(APAAP)染色法を用いて細胞浸潤を検出するために、移植した心臓のクライオスタット部分を作成しました。50倍の倍率を持つ単一フレームを1つの合成画像にマージし、完全な移植片の概要と浸潤細胞の分布を与えた。組織学的分析は、同種移植片における免疫細胞(例えば、CD4+、TCR+、またはNKR-P1A/B+)の浸潤の増加を示したのに対し、シンゲン移植片は細胞浸潤をほとんど含んでいない(図7A-C)。+++
上記の株の組み合わせにおける心筋細胞の耳注入後にリンパ節細胞を排出する子宮頸部リンパ節切法および再刺激アッセイは、同種心臓組織に対する明確な株特異的免疫応答を明らかにし、サイトカインプロファイリングなどのさらなる免疫学的分析を可能にした(図8A-C)。
図1:エンドツーサイドのアナストモーゼと結果として生じる血流が心臓を通る模式的な提示。ドナーが大動脈を受け取った腹部大動脈にエンドツーサイドで上昇し、肺動脈をレシピエント下静脈(A)に類似して麻酔した後、上り大動脈を介して冠動脈に血流が入る。静脈内の排水は、右心房と心室に静脈コロナリウスを介して、そして肺動脈を介してレシピエント下静脈(B)に起こる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:必要な手術器具および材料。(A)エクスプランテーション:1:弾性四肢バンド、2:レトラクター、3:5-0合字、4:プローブ尖ったはさみ、5-6:マイクロ針ホルダー、7:はさみ、8:外科用鉗子、9:マイクロ鉗子、10:眼滑剤、11:圧縮、12:綿棒、13:灌流ベース、14:saline ice ice solution(B)移植:1:弾性肢帯、 2:レトラクター、5-6:マイクロニードルホルダー、7:はさみ、8:鉗子、9:マイクロ鉗子、10:目の潤滑剤、11:圧縮、12:綿棒、15:マイクロハサミ、16:マイクロ鉗子、17:ポッツハサミ、18:針ホルダー、19:アーチ缶、20:20:20:211モノフィラメント縫合線、22:止血性ガーゼ、23:3-0ポリフィラメント縫合、24:ペトリ皿、25:カルプロフェン(5mg/mL)、26:局所麻酔薬(リドカイン0.2%)、27:生理食合溶液。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:心臓の排泄物。ヘパリン化後(A)、開血術が行われ、大動脈と肺動脈の上昇が可能な限り遠位(B)切断される。1つの合字肺と両方の騎静脈が閉塞している(C)、心臓は胸腔から取り除かれる(D)。(E)は、ヘパリンをF含む30 mL生理食液を灌流した後の心臓を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:心臓移植。腹部血管の博覧会とクーリー血管クランプの配置(A)の後、血管はカニューレート(B)であり、縦切開はポッツハサミ(C-D)を使用して行われる。ドナー上昇大動脈は、レシピエント腹部大動脈(E)の切開部の頭蓋および尾角にそれぞれ1つの結び目で固定され、吻合は縫合糸(E−F)を連続的に動かすことによって行われる。移植片は、吻合の前半(E)の血管の右側に置かれ、吻合の後半(F)とその後の静脈吻合のために血管の左側に置かれることに注意してください。静脈吻合の前半は、イントラミナル縫合糸(G)によって行われる。静脈吻合の後半を終えた後、移植片は再灌流の準備ができています(H).この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:同種心筋細胞のインイヤー注射。両側テープを使用して受け手の耳を指に固定した後(A)、同種の重要な心筋細胞を、視覚毛細血管(B)に近い皮下に注入する。子宮頸部リンパ節を排出する観察期間の後(*)が抽出される(C)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:異なるシンジェニックおよび同種ドナーとレシピエントの組み合わせにおける心臓生存。カプランマイヤー分析は、シンジェニック(n=10速拒絶モデル;n=5長期拒絶モデル)および同種移植片(n=11高速拒絶モデル;n=14長期拒絶モデル)の生存を示す。長期拒絶モデルでは、14人のレシピエントのうち6人が、移植片の故障なしに観察期間(60日)の終わりに達し、この群では移植片生存期間が長引いた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:シンジェニックおよび同種の心臓移植片の組織学的分析(A-B)は、シンジェニック移植片(A)および拒絶反応時の同種移植片(B)におけるAPAAP染色法を用いたCD4+細胞の浸潤を示す( B)(C)は、異なる免疫細胞サブセットに対するシンジェニック移植片(参照群として機能する)と比較した場合の同種移植片における細胞浸潤の増加を示す。細胞浸潤を定量化するために適用された分類は、ヒルシュブルガーら25:0=シンジェニック移植片に匹敵する浸潤から修飾された。0.5 = 単離された組織切片における染色細胞のわずかな増加;1 = 組織セクション全体に対する単数染色細胞の増加;1.5 = 組織セクション全体に均一に分布した染色細胞クラスターの増加;2 = 強い;2.5 = 非常に強い;3 = 組織セクション全体を通して染色された細胞クラスターの最も強い増加。移植片の組織学的セクションを50倍の倍率で分析した。1群当たり5つの移植片(それぞれシンジェニックおよび同種性)が分析に含まれていた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:同種心筋細胞の耳内注射後のリンパ節細胞の排出の分析リューwtとの急速な拒絶の子宮頸部または間膜リンパ節(LN)を排出から収穫した2 x 105リンパ球の特異的再刺激(それぞれのドナー株の2 x 105脾細胞を有する) 長期拒絶されたLew.1aレシピエントは、Lew.1aレシピエント(A)におけるリンパ節細胞の排出増殖を有意に減少させたのに対し、一般的にはCD3/CD28抗体による非特異的刺激(B)の後に増殖能力が依然として観察可能であった。驚くべきことに、サイトカインプロファイリングは、長期拒絶レシピエントのリンパ節における炎症性サイトカインの増加を明らかにした(C)。結果は、グループごとに少なくとも4匹の動物の平均±SEMとして提示される。有意性は p 値 ≤ 0.05 の場合は * で示され、p 値 ≤ 0.0001 の場合は ****で示されます。(この図はBeetzら24から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラットにおける異所性心移植の先に説明した方法は、主に1969年の大野とリンジーの記述に基づく3.それ以来、このモデルの多様性を広げ、様々な種に幾つかの改変が導入されている。これらの変更のいくつかを組み合わせ、実験室で異所性心臓移植を行った30年以上の経験を紹介し、長いトレーニング期間や外科的背景を必要としない実行可能な外科的アプローチを作成しました。以下では、このモデルの一般的な制限事項を説明し、プロトコルの重要な手順に下線を引く。さらに、異所性心臓移植と心筋細胞の耳内注射の新しい方法を組み合わせることの利点を強調する。
麻酔と一般的な合併症
イソフルラン麻酔は、異所性心臓移植後の早期生存に関する注射麻酔よりも優れていると報告されているが、術中呼吸抑制は依然として最も一般的な合併症の1つであり、従って慎重なナルコシス管理26を必要とする。シリアルグラフトの排泄および移植の代わりに、我々は、特に1時間未満の手術時間が移植片およびレシピエント生存26、27,27に関するより良い結果に関連しているため、ドナー動物のレシピおよび腹部血管の準備を開始することを助言する。長時間の運転時間や加熱マットの欠損による低体温症、腸管の壊死や腸の生理学的配置による閉塞などの合併症に既に言及されているほか、ヒンダー肢の麻生はさらなる合併症を表し、これは外傷性血管クランプとアナストモーゼの徹底的な洗い流しによって防ぐことができる末梢塞28,29。,29
肺静脈と騎静脈の合字と出血合併症
暖かい虚血時間を短縮するために、我々は両方の騎兵静脈と4つの肺静脈の両方に1つの合字を使用しています。合字の近位/腹側配置に起因する合併症の可能性として、正気コロナリウスの閉塞による静脈逆流の破壊が挙げられる。クーリークランプの除去後に重度の出血が発生し、移植片の目に見える拍動の場合、合字はすぐに不全をチェックする必要があります。我々は、特に肺静脈の解剖が胸部腔から移植片を除去しながら合字に近づきすぎた場合に、この種の合併症を観察した。それ以外の場合、重度の出血は主に血管性血管性血管系の不全によって引き起こされる。さらに、排泄時にしばしば切断される上昇大動脈に沿って走る冠状動脈は、再灌流27時に致死的出血を引き起こすと記載されている。
虚血時間と灌流
移植モデルに関わらず、特に心臓は虚血の損傷に関して脆弱な臓器と考えられているので、虚血時間を短縮することは常に不可欠です。2人の外科医との手術を行うことによって、我々は最低の暖かく、冷たい虚血時間を達成することができ、したがって虚血再灌流損傷30を減らすために心肢麻痺溶液の使用を見過ごすことができる。一般的に、移植片の灌流は重要な役割を果たし、移植片を冷却し、血栓症または塞栓症を引き起こし得る血液細胞を除去するために不可欠である。低い灌流圧は、不十分な灌流を導き、血液細胞の不完全な除去に至る一方で、高い灌流圧は内皮損傷31、32,32を引き起こす可能性がある。冠状動脈が目に見えて紅潮するまで、肺動脈の灌流と上昇大動脈の灌流をお勧めします。
受領船の切開
プロトコルの重要なステップは、後壁の血管に損傷を与えることなく受容器の切開を構成する:Schmidらは、小さな横断切開を行い、その後頭蓋および尾方向に縦方向の拡大を行う大動脈切除術または毒物の利点を説明し、さらに耳膜内の狭窄率の低下につながる。私たちのモデルでは、受取人の容器は小さなカニューレを使用して穿刺される。その後、穿刺部位は、縦切開を作成するためにポッツハサミを使用して拡大されます。より良い実現のために、カニューレの先端を30〜45°の角度に曲げて、船の後壁を損傷するリスクを減らすことをお勧めします。私たちは、受け取った人のいずれにも臨床的に関連する血管ステノースを観察しませんでした。腹部大動脈と下の大静脈をカニューレで穿刺することによって受容器を開くことの同様の利点は、Shanららによって記述されている。
異所性心臓移植のモデルをマスターする
過去10年間、このモデルは外科的背景がほとんどまたはまったくない部門の研究者によって行われてきた。上記のように、我々は外科医のペアで動作しますが、より経験豊富な研究者は、移植の成功を保証し、経験のない研究者のスキルセットを徐々に改善するのと同じです。死んだ動物に約10個の移植片の排泄物と移植の短い訓練期間の後、経験の浅い研究者は、心臓の排泄を行い、約10匹の生きた動物の移植を支援する責任を負います。その後、未経験の研究者は血管性アナストモーゼを積極的に行い、約10の移植後、元未経験の研究者は通常、モデルのすべての重要なステップを実行することができる。
このトレーニングコンセプトを適用すると、ラットにおける異所性心臓移植を用いた当社の部門からの過去の出版物は、外科医,,,,13、18、18、19、20、21、22、23、2418のいくつかの異なるチームにもかかわらず、罹患率、死亡率20または21移植機能に関する違いを示さなかった。,2413192223
注意すべきは、血管性アナストモーゼを行うことは、一般的に、このプロトコルおよび固体臓器移植モデルにおける最も重要なステップを表す。したがって、特に経験豊富な研究者が生きている動物の指導に利用できない場合は、アナストモーゼが正確かつ迅速に行われるまで、死んだ動物を使用して長期間の訓練を行うことをお勧めします。
モデルの一般的な利点と欠点
自発的な寛容誘導は、肝臓移植の現象としてしばしば説明され、腎臓移植でも観察されるのに対し、心臓はかなり免疫原性器官であると考えられ、移植モデル35,36,36で信頼できる拒絶反応を可能にする。これらの知見とは対照的に、完全な主要な組織適合性複合体格差にもかかわらず、特定のドナーとレシピエントの組み合わせにおける異所性心臓移植後の長期生存および拒絶反応の欠如にも気付くことができる。
異所性心臓移植に対するしばしば言及された批判は、手動触診による移植片モニタリングの主観である。従って、触診のためのアクセスを容易にし、経大心エコー検査15,16,16のようなさらなるモニタリング技術を導入するために、モデルは大腿骨吻合技術に拡張されている。一方、Mottramら. 触診による移植片のモニタリングは心電学的測定37とよく相関していることを実証した。したがって、異所性心臓移植における手動触診は、急性拒絶モデルにおける移植片機能を監視するのに十分であると思われる。
異所性配置と左心室のアンロードの結果として、心臓は、これが免疫学的分析に影響を与えないと仮定して、解剖学的または生理学的条件下で機能しない。この仮定とは対照的に、左心室補助装置療法中の左心室の荷下ろしに起因する心臓リモデリングが、サイトカイン放出38,39,39の減少につながることが示されていた。一方、Tang-Quanらは、アンロードされた設定を免疫学的分析に対してより適切なアプローチとして説明し、左心室装填モデルにおける部分的に脱酸素された血液との灌流に起因する移植片の長期虚血損傷が40を観察したからである。
移植片の腹部の配置は、実践性の面で外科的利益を提供するが、さらなる分析を損なう移植片拒絶の際に、十分な数の後腹膜リンパ節を十分に収穫することは困難である。このため、同種心筋細胞のインイヤーインイヤー注射法を紹介しました。パラジサイト学的研究から生まれたこの概念は、その実現可能性が41,42,42であるにもかかわらず、移植における免疫学的分析には適用されていない。このモデルの利点は、複雑な免疫学的分析を行う可能性を提供する大量の排出リンパ節を同定して収穫する可能性である。注意すべきは、両方のモデルを1つのレシピエントに組み合わせることで、ラットにおける細胞および臓器移植における拒絶反応と耐性のメカニズムに関するさらなる洞察を提供することができる。
ラット心臓および心筋細胞移植の私達のモデルは実用的でよく研究されたアプローチを表し、さらに外科訓練または背景なしで行うことができる。最近、ラットの新しいクローニング技術が導入され、開発されたという事実に直面して、これらのモデルは移植免疫学的研究者に大きな機会を提供します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ブリッタ・トラウテヴィヒ、コリンナ・レーバート、イングリッド・メダーのコミットメントに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
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