Summary
Ce protocole décrit un test in vivo de phagocytose utilisé pour évaluer et quantifier la capacité des jeunes et âgés Drosophila melanogaster hémocytes aux bactéries phagocytose.
Abstract
La phagocytose est une fonction essentielle de la réponse immunitaire innée. Ce processus est effectué par des hémocytes phagocytiques dont la fonction principale est de reconnaître un large éventail de particules et de détruire les pathogènes microbiens. À mesure que les organismes vieillissent, ce processus commence à diminuer, mais on sait peu de choses sur les mécanismes sous-jacents ou sur la base génétique de l’immunosénescence. Ici, une injection basée sur l’essai in vivo phagocytose est utilisée pour évaluer les changements liés à l’âge dans différents aspects de la phagocytose, tels que la liaison, l’engloutissement, et la dégradation des particules intériorisées, en quantifiant les événements phagocytiques dans les hémocytes chez les adultes Drosophila. Drosophila melanogaster est devenu un modèle idéal pour étudier les changements liés à l’âge dans la fonction immunitaire innée pour de nombreuses raisons. D’une part, de nombreux composants et fonctions génétiques de la réponse immunitaire innée, y compris la phagocytose, sont conservés évolutionnellement entre la Drosophila et les mammifères. Pour cette raison, les résultats obtenus à partir de l’utilisation de ce protocole sont susceptibles d’être largement pertinents pour comprendre les changements liés à l’âge dans la fonction immunitaire dans une variété d’organismes. En outre, nous notons que cette méthode fournit des estimations quantitatives de la capacité phagocytique des hémocytes, qui pourrait être utile pour une variété de sujets de recherche, et ne doit pas être limitée à des études sur le vieillissement.
Introduction
Le système immunitaire inné, qui se compose de barrières physiques et chimiques à l’infection ainsi que les composants cellulaires, est évolutif conservé à travers les organismes multicellulaires1,2. En tant que première ligne de défense, le système immunitaire inné joue un rôle essentiel dans la lutte contre les pathogènes envahissants chez tous les animaux1,2,3. Les composants de la réponse immunitaire innée comprennent un large éventail de types de cellules qui sont classés sur la base qu’ils manquent de spécificité et de mémoire immunologique2,3,4. Chez l’homme, ces types de cellules incluent les monocytes et les macrophages phagocytiques, les neutrophiles et les cellules tueuses naturelles cytotoxiques4,5. Bien qu’avoir un système immunitaire fonctionnel est impératif pour la survie de l’hôte, il est clair que la fonction des cellules immunitaires diminue avec l’âge, un phénomène connu sous le nom d’immunosénescence5,6. Être en mesure d’évaluer les changements liés à l’âge dans la réponse immunitaire, y compris les différents aspects du processus de phagocytose, pourrait aider à notre compréhension de l’immunosénescence. La procédure que nous décrivons ici fournit une approche efficace et répétable pour évaluer et quantifier les événements phagocytiques par les hémocytes dans Drosophila melanogaster.
Drosophila est un modèle idéal pour étudier la réponse immunitaire pour de nombreuses raisons. D’une part, il existe un ensemble complet d’outils génétiques qui permettent de manipuler facilement l’expression des gènes d’une manière dépendante des tissus7. Ces outils comprennent une collection de mutants, des stocks d’interférence d’ARN, des stocks GAL4/UAS, et le panneau de référence génétique de Drosophila qui contient 205 lignes différentes consanguines pour lesquelles les séquences entières du génome sont cataloguées8. Le court cycle de vie de Drosophila et le grand nombre d’individus produits permettent aux chercheurs de tester plusieurs individus dans un environnement contrôlé, dans un court laps de temps. Cela améliore grandement la capacité d’identifier les différences subtiles dans les réponses immunitaires à l’infection chez les génotypes, entre les sexes ou à travers les âges. Fait important, de nombreux composants et fonctions génétiques de la réponse immunitaire innée, y compris la phagocytose, sont conservés évolutionnellement entre la Drosophila et les mammifères1,2.
Dans Drosophila, le processus de phagocytose qui suit l’infection est effectué par des hémocytes phagocytiques appelés plasmatocytes, qui sont équivalents aux macrophages mammifères9. Les hémocytes sont essentiels pour reconnaître un large éventail de particules et éliminer les agents pathogènes microbiens9,10,11,12,13. Ces cellules expriment une variété de récepteurs qui doivent se différencier de non-soi, et d’initier les événements de signalisation nécessaires pour effectuer le processus phagocytique10,11,12,13,14,15. Une fois qu’une particule est liée, elle commence à être intériorisée par la réorganisation du cytosquelette actine et le remodelage de la membrane plasmatique pour se développer autour de la particule, formant une tasse phagocytique11,12,13,14. Au cours de ce processus, un autre ensemble de signaux indique à la cellule d’intérioriser davantage la particule en fermant la tasse phagocytique, formant un phagosome11,12,13,14,15. Le phagosome subit alors un processus de maturation, s’associant à différentes protéines et fusionnant avec des lysosomes, formant un phagolysome acide11,12,13,14,15. À ce stade, les particules peuvent être efficacement dégradées et éliminées11,12,13,14,15. Drosophila études ont révélé que les mouches plus âgées (4 semaines d’âge) ont une capacité réduite pour effacer une infection par rapport aux mouches plus jeunes (1 semaine), probablement due, au moins en partie, à une baisse dans certains aspects de la phagocytose16,17.
La méthode décrite ici utilise deux particules distinctes d’E. coli, l’une portant un fluorophore standard et l’autre sensible au pH, pour évaluer deux aspects différents de la phagocytose : l’engorgement initial des particules et la dégradation des particules dans le phagolysome. Dans ce test, la fluorescence des particules fluorées est observable lorsque les particules sont liées et englouties par les hémocytes, tandis que les particules sensibles au pH fluorent uniquement dans les conditions de pH bas du phagosome. Des événements fluorescents peuvent alors être observés dans les hémocytes qui se localisent le long du récipient dorsal. Nous nous concentrons sur les hémocytes localisés au vaisseau dorsal, qui fournissent un repère anatomique pour localiser les hémocytes qui sont connus pour contribuer au dégagement bactérien, et de les isoler uniformément. Cependant, les hémocytes dans d’autres parties du corps et l’hémolymphe sont également importants pour le dégagement. Bien que nous n’ayons pas étudié cette population cellulaire, notre procédure générale pourrait être applicable pour les essais phagocytiques de ces cellules aussi bien. Un avantage de notre approche est que nous pouvons quantifier les événements phagocytes dans les hémocytes individuels, nous permettant de détecter la variation subtile dans les processus phagocytiques. D’autres études qui visualisent les événements fluorescents à travers la cuticule18,19 ne tiennent pas compte des différences dans le nombre d’hémocytes présents, ce qui est particulièrement important à considérer dans notre cas que le nombre total d’hémocytes devraient changer avec l’âgede 17ans .
Protocol
1. Recueillir et l’âge Drosophila
- Pour générer les mêmes mouches F1 âgées pour tester la phagocytose, ajoutez 5 à 10 femelles vierges et 5 mâles des génotypes appropriés à un flacon contenant de la nourriture fraîche pour mouches. Nous utilisons une mélasse de maïs agar à base d’aliments20, mais la méthode devrait fonctionner quel que soit le type de régime alimentaire sur lequel les mouches sont élevés. Pour cette expérience, nous avons utilisé Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP vole pour étiqueter les hémocytes génétiquement.
REMARQUE : Plus de mouches peuvent être utilisées, mais certaines lignes de D. melanogaster peuvent ne pas s’accoupler ou se reproduire bien lorsqu’elles sont surpeuplées, et la surpopulation peut avoir des effets néfastes sur le développement larvaire21 et la phagocytose. - Maintenir les mouches dans les conditions expérimentales souhaitées. Pour cette expérience, maintenez He-GAL4; UAS-GFP vole à 24 °C. Laissez les mouches adultes s’accoupler pendant une semaine, puis retirez les adultes. Les mouches F1 seront ensuite recueillies à partir de ces flacons après l’éclosion pour une utilisation expérimentale.
- Recueillir les mouches vierges tout au long de la semaine, ou jusqu’à ce que le nombre souhaité de mouches sont recueillies. Les vierges ne sont pas nécessaires; cependant, l’accouplement peut avoir un impact sur la réponse immunitaire. Si les mouches F1 doivent être testées en tant que vierges, séparer les mâles et les femelles dans les 8 heures suivant l’éclosion et les entretenir dans des flacons séparés pour prévenir l’accouplement. Recueillir suffisamment de mouches pour permettre l’évaluation de la phagocytose chez au moins 10 mouches par génotype/traitement/sexe par âge.
- Si le vieillissement des mouches à une semaine, recueillir au moins 50 mouches au total, ou 20 mouches par condition de traitement pour chaque particule, soit fluoro-particules ou particules sensibles au pH, à injecter. Cela permettra d’assurer un minimum de 10 mouches à l’essai au moment de l’expérience.
- Si le vieillissement vole à plus de 3 semaines, recueillir au moins 100-150 mouches au total, ou 50-75 mouches par condition de traitement pour s’assurer qu’il ya suffisamment de mouches disponibles pour mesurer la phagocytose. Lorsque le vieillissement des mouches dans le laboratoire, nous utilisons généralement des cages d’insectes maintenues à 24 °C en 12:12 L:D conditions, et de changer la nourriture tous les deux jours. Si des flacons sont utilisés au lieu de cages, la pointe vole dans de nouveaux flacons tous les 3-5 jours, selon l’état de la nourriture dans le flacon. Le nombre de mouches nécessaires dépendra de la façon dont la phagocytose d’âge sera analysée tardivement, et les taux de survie spécifiques à l’âge de ce génotype dans un état environnemental particulier.
- Si les mouches jeunes et âgées sont évaluées, prévoyez en conséquence afin que les mouches âgées d’une semaine et âgées soient injectées le même jour. Cela permettra de minimiser les variations de la concentration des particules entre les expériences et de s’assurer que l’effet de l’âge sur la mesure phagocytique n’est pas confondu avec l’effet du jour où l’essai a été effectué.
- Loger les mouches recueillies à 24 °C jusqu’à ce qu’elles aient entre 5 et 7 jours, ou maintenir les mouches à l’âge désiré.
2. Préparer des particules fluorescentes
- Reconstituer les particules fluoro-fluoro-coli tuées par la chaleur ou les particules sensibles au pH E. coli à une concentration de stock de 20 mg/mL ou 1 mg/mL, respectivement. D’autres bactéries sont disponibles pour une utilisation qui peut être plus approprié pour certaines expériences, mais se réfèrent aux instructions du fabricant pour les concentrations appropriées de stock.
- Pour les particules fluoro, ajouter 990 μL de 1x PBS (pH 7,4) ou tampon préféré et 10 μL de 2 mM (20%) azide de sodium. Vortex à mélanger.
REMARQUE : L’azide de sodium est un agent de conservation qui peut être omis; cependant, les particules préparées sans azide de sodium ne durent pas aussi longtemps. Les particules fluoro doivent être utilisées dans les 24 heures et les particules sensibles au pH doivent être utilisées dans les 7 jours. - Pour les particules sensibles au pH, ajouter 1 980 μL de 1x PBS (pH 7,4) ou tampon préféré et 20 μL de 2 mM (20 %) azide de sodium. Vortex à mélanger.
- Faire plusieurs aliquots à usage unique de 20 μL dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 m L. Stockez les particules fluoro à -20 °C pendant un an et les particules sensibles au pH à 4 °C pendant jusqu’à 6 mois, à l’abri de la lumière.
- Pour les particules fluoro, ajouter 990 μL de 1x PBS (pH 7,4) ou tampon préféré et 10 μL de 2 mM (20%) azide de sodium. Vortex à mélanger.
- Le jour des injections, retirer l’azide de sodium des particules avant utilisation. Pour ce faire, centrifugez les particules pendant 5 min à 15 000 x g à température ambiante.
- Retirez le supernatant et lavez les particules deux fois en résuspendant dans 50 μL de 1x PBS ou tampon préféré, et centrifuge pendant 5 min à 15 000 x g.
- Après le deuxième lavage, retirez les particules supernatantes et resuspendez dans 100 μL de 1x PBS ou tampon préféré. Gardez la solution dans le tube et minimisez l’exposition à la lumière tout au long de l’expérience. Une fois l’azide de sodium éliminé, utilisez des particules fluoro dans un rayon de 24 h et utilisez des particules sensibles au pH utilisées dans les 5 à 7 jours.
NOTE : Dans nos expériences précédentes, nous avons constaté que cette concentration de particules fournissait des nombres dénombrements d’événements phagocytiques et que le nombre de particules disponibles pour la phagocytose par les hémocytes ne limitait pas17. Cependant, les utilisateurs de ce protocole peuvent vouloir comparer les résultats en utilisant d’autres concentrations pour s’assurer qu’il y a un nombre suffisant de particules disponibles pour la phagocytose par les hémocytes dans les conditions de leurs expériences.- Si l’azide de sodium a été omis, diluer les particules 1:5 dans le même tampon que les particules ont été préparés avec, pour les injections.
- Ajoutez une goutte (~10 μL) de colorant alimentaire vert aux particules. Il est ainsi plus facile de s’assurer que les mouches ont été injectées.
3. Injecter les mouches
- Préparer des aiguilles en verre pour les injections.
- Tirez des aiguilles en verre à l’aide d’un puller de pipette. Réglez le chauffe-pousse pipette à 55 °C et le solénoïde à 45. Utilisez uniquement les aiguilles fournies avec l’injecteur, car il n’est pas garanti que d’autres aiguilles fonctionneront avec la même précision.
- Remplissez une seringue stérile de 1 mL d’huile minérale et attachez l’aiguille hypodermique (G) de calibre 30, fournie avec le nano-injecteur.
- Remplir l’aiguille capillaire tirée en insérant l’aiguille de 30 G dans l’extrémité émoussée de l’aiguille en verre tiré et remplir d’huile minérale. Retirez lentement l’aiguille de 30 G, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air dans toute l’aiguille, car cela peut causer des volumes d’injection inexacts. L’injecteur ne fonctionnera pas correctement sans remblayer l’aiguille.
- À l’aide de forceps, détachez le bout de l’aiguille pour créer une ouverture pour permettre l’éjection de la solution.
- Assembler le nano-injecteur.
REMARQUE : D’autres injecteurs peuvent être utilisés. La méthode décrite ci-dessous s’applique au nano-injecteur. Pour les autres injecteurs, consultez le manuel d’utilisation pour obtenir des instructions.- Réglez l’injecteur sur le volume souhaité (entre 46 nL et 69 nL).
- Retirez le collet et placez l’anneau O d’étanchéité, l’espaceur blanc avec l’indentation orientée vers le haut pour recevoir l’extrémité arrière de l’aiguille, et le plus grand O-anneau sur le piston en métal, dans cet ordre. Rattacher le collet sans le serrer.
- Insérez le piston métallique dans l’extrémité émoussée de l’aiguille en verre remplie d’huile. Poussez doucement l’aiguille vers le bas, en l’insérant dans le plus grand O-ring. Serrer le collet jusqu’à ce qu’il soit sécurisé.
REMARQUE : Si le piston métallique ne s’étend pas au-delà du collet, appuyez et maintenez ' EMPTY jusqu’à ce que le piston soit visible. Il est ainsi plus facile de s’assurer que le piston est inséré dans l’aiguille. - Appuyez et maintenez 'EMPTY' jusqu’à ce que l’injecteur bipe. Cela éjecte la majeure partie de l’huile minérale de l’aiguille, laissant un petit volume d’huile pour agir comme une barrière entre les deux liquides, ainsi que supprime les bulles d’air.
- Remplissez l’aiguille de particules fluoro-particules ou de particules sensibles au pH en insérant la pointe de l’aiguille de verre dans le tube de microcentrifuge contenant les particules préparées.
- Appuyez et maintenez ' FILL' jusqu’à ce que l’injecteur bipe.
- Injections
- Transférez les mouches qui doivent être injectées dans une fiole vide. Immobiliser les mouches en plaçant la fiole dans la glace. Le CO2 peut également être utilisé pour immobiliser les mouches. Toutefois, notez que, lors de l’utilisation de particules sensibles au pH, des niveaux élevés de CO2 peuvent acidifier artificiellement tous les tampons utilisés et peuvent élever la fluorescence de fond.
- Injecter les mouches dans la plaque sternopleural du thorax (Figure 1A). L’injection est réussie si on voit des colorants verts entrer dans la mouche (Figure 1B). Si la mouche ne passe pas au vert, assurez-vous que l’aiguille n’est pas obstruée.
REMARQUE : Alternativement, les mouches peuvent être injectées dans l’abdomen, mais gardez le site d’injection cohérent dans toutes les expériences. - Placez les mouches injectées dans un nouveau flacon alimentaire, en notant l’heure à laquelle la première et la dernière mouche ont été injectées. Pour minimiser les erreurs expérimentales dues au temps qu’il faut pour effectuer les injections, effectuez les injections en temps opportun. Avec la pratique, il ne faut pas plus de 10 min pour injecter un ensemble de mouches. Déposer le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient rétablies, afin d’éviter que les mouches ne restent coincées dans la nourriture.
- Laisser les mouches se rétablir pendant 60-90 min, selon les conditions expérimentales. Ici, un temps de récupération de 60 minutes a été utilisé. Notez que cette plage de temps de récupération était optimale pour compter les événements phagocytiques dans les conditions expérimentales de l’étude Horn et coll.17. Cependant, dans certaines conditions, cela peut être trop long pour détecter des différences subtiles dans la phagocytose entre les groupes de traitement. Il peut être utile d’effectuer des expériences de cours de temps comme cela a été fait précédemment17 pour déterminer le temps de récupération qui révélera des différences maximales entre le contrôle et les résultats expérimentaux. Quel que soit le temps de récupération choisi, gardez cette cohérence dans tous les traitements expérimentaux.
- Si vous injectez des particules fluoro-particules et des particules sensibles au pH le même jour, utilisez une nouvelle aiguille pour chaque solution. N’injectez pas les mouches individuelles avec les deux particules si elles fluorent toutes les deux le rouge, puisque le résultat ne ferait pas de différence entre les deux aspects de la phagocytose, liaison/engloutissement des particules par rapport à l’inclusion de particules dans le phagosome.
4. Disséquer le récipient dorsal
- Une fois que les mouches se sont rétablies pendant 60-90 min, transférez toutes les mouches vivantes vers une fiole vide et immobilisez-les sur la glace.
- Transférer une mouche à la fois sur une plaque de dissection d’élastomère en silicone.
REMARQUE : Préparer les plaques de dissection au moins 1 semaine avant l’utilisation, si vous le guérissez à température ambiante. Pour ce faire, préparer l’élastomère et le verser dans une boîte de Pétri de 33 mm x 10 mm, en remplissant le plat environ à mi-chemin. Appuyez doucement sur le plat sur une surface plane pour minimiser les bulles d’air. Laisser reposer les assiettes à température ambiante, sans être dérangées, pendant au moins une semaine.- Sous un microscope stéréo disséquant, orientez le côté ventral de mouche vers le haut.
- À l’aide d’épingles d’insectes, épingler la mouche sur la plaque en insérant une goupille à travers le thorax et une autre broche à travers l’extrémité la plus postérieure de l’abdomen, près des organes génitaux (Figure 2A). Il peut être utile de couper les broches en deux avant d’épingler le spécimen afin de ne pas obstruer la dissection. Répéter avec jusqu’à 10 mouches par plaque de dissection.
REMARQUE : Facultatif : Retirez les ailes et les jambes avant d’épingler la mouche sur la plaque. Cela aidera à empêcher une bulle de se former autour de la mouche lorsque le média est ajouté. - Une fois que toutes les mouches ont été épinglées à la plaque, ajoutez suffisamment de support de dissection pour couvrir les mouches (~1 mL) à l’aide d’un pipet de transfert.
- À l’aide de forceps ou de ciseaux de cuticule, retirez la tête.
- À l’aide de ciseaux de cuticule, faire deux incisions horizontales: l’une directement au-dessus de la broche postérieure dans l’abdomen, et l’autre à l’extrémité la plus antérieure de l’abdomen, où le thorax et l’abdomen se rencontrent (Figure 2B, C). Dans la figure 2, la tête a été laissée intacte pour clarifier l’orientation.
- Faire une incision verticale, reliant les deux incisions horizontales (les trois coupes ressemblent à la lettre I). Cela ouvrira la cavité abdominale (Figure 2D).
- À l’aide de forceps, enlever les organes internes et les tissus, en évitant le vaisseau dorsal. S’il n’est pas perturbé, on peut souvent voir le récipient dorsal transparent pulser près de l’extrémité antérieure de l’abdomen. Des broches supplémentaires peuvent être utilisées pour épingler les extrémités nouvellement coupées de la cuticule (Figure 2E, F).
- À l’aide de ciseaux de cuticule, retirer le thorax. Alternativement, le thorax peut être enlevé avant de monter les cuticules disséquées et le récipient dorsal sur une lame de microscope.
- Répéter avec les mouches restantes. disséquer les mouches en temps opportun, afin de minimiser les variations possibles du taux phagocytique. Une fois que toutes les mouches ont été disséquées, laissez les cuticules avec le récipient dorsal attaché épinglé à la plaque. Toute l’étape 5 sera effectuée dans la plaque de dissection. Ceci empêchera d’endommager ou de jeter accidentellement des cuticules entre les étapes.
5. Fixation et coloration
- Fixer les cuticules disséquées avec le récipient dorsal attaché dans 4% de paraformaldéhyde (PFA).
- À l’aide d’un nouveau pipet de transfert jetable pour chaque étape, jetez le support de dissection et remplacez-le par 1 mL de 4 % de PFA. Tout au long de la fixation et de la coloration, garder les dissections protégées de la lumière autant que possible.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min avec bascule à 20 tr/min. Ne laissez pas les dissections s’asseoir dans fixatif pendant plus de 20 min, car cela pourrait commencer à endommager le tissu.
- Laver les cuticules 2x en 1x PBS + 0,1% Tween (PBST).
- Retirez le fixatif et remplacez-le par 1 mL de 1x PBST.
- Laver à température ambiante pendant 15 min avec le balancement.
- Répétez 1x.
REMARQUE : Les tissus disséqués et fixes peuvent être stockés à 4 °C, jusqu’à 3 jours, protégés de la lumière, après le premier lavage en remplaçant le lavage par du PBST frais. Ne stockez pas de tissus fixes si des anticorps sont utilisés. Les anticorps doivent être utilisés avec des tissus frais pour obtenir de meilleurs résultats.
- Facultatif : Coloration d’anticorps. Les anticorps peuvent être utilisés pour visualiser clairement le vaisseau dorsal(figure 3)ou pour détecter des marqueurs spécifiques aux hémocytes. Cela peut garantir que seules les cellules le long du récipient dorsal sont comptées ou pour marquer la membrane des hémocytes.
- Retirer le deuxième lavage, ajouter l’anticorps primaire à la dilution appropriée. Incuber toute la nuit à 4 °C, à bascule.
- Retirer l’anticorps primaire et laver deux fois avec le PBST pendant 15 min avec le balancement.
- Ajouter un anticorps secondaire fluorescent. Nous recommandons un anticorps vert-fluorescent afin qu’il n’obscurcisse pas les particules fluorescentes. Incuber à température ambiante pendant 2 h, à bascule.
- Retirer l’anticorps secondaire, laver deux fois pendant 15 min chacun avec PBST.
- Tache avec DAPI.
- Retirer le lavage final et remplacer par 1 mL de DAPI dilué dans PBST (1:1000).
- Tacher pendant 20 min avec bascule à température ambiante.
- Retirez le DAPI et lavez 2x (répétez l’étape 5.2).
- Remplacer le lavage final par un pbst 1x frais.
REMARQUE : Les mouches peuvent être stockées à 4 °C, jusqu’à 3 jours, protégées de la lumière, après le premier lavage en remplaçant le lavage par du PBST frais.
6. Montage de cuticules sur des lames de microscope et d’imagerie
- Préparer des cuticules disséquées.
- Sous le stéréomicroscope disséquant, couper l’excès de cuticule qui pourrait interférer avec l’imagerie.
- À l’aide de forceps, transférer les cuticules avec le récipient dorsal attaché dans un tube de microcentrifuge de 1,5 m L contenant 70 % de glycérol. Placer les cuticules dans le glycérol aidera à supprimer PBST et permet une image plus claire pendant l’imagerie.
- Monter les cuticules sur la lame du microscope.
- Ajouter quelques gouttes de glycérol à 70% à une lame de microscope.
- À l’aide de forceps, retirer les cuticules du tube de glycérol et placer dans le glycérol sur la lame.
- Sous le microscope stéréo disséquant, utilisez des forceps pour orienter les cuticules côté ventral vers le haut, en veillant à ce que le récipient dorsal soit visible. Le pigment plus foncé de la cuticule sera face vers le bas.
- Ajouter une goutte supplémentaire de glycérol, si nécessaire. Cela permet de prévenir les bulles d’air et permet une image plus claire.
- Placez délicatement un couvercle sur les cuticules et sceller les bords avec du vernis à ongles. Laisser sécher de 10 à 15 min avant de procéder. Imagez immédiatement les mouches ou rangez-les dans une boîte à l’épreuve de la lumière à 4 °C.
- Image du vaisseau dorsal.
- À l’aide d’un microscope fluorescent, utilisez le système d’interférence structurale pour produire des sections optiques du récipient dorsal. Un microscope confocal peut alternativement être utilisé qui peut fournir une précision supplémentaire. Obtenez des images de la pile Z du vaisseau dorsal à l’aide d’un logiciel d’imagerie objectif 20x et préféré. Ajoutez une barre d’échelle de 10 mm et étiquetez et enregistrez correctement les images sous forme de fichiers tiff (figure 4) ou de format souhaité.
REMARQUE : Le nombre d’images de la pile Z obtenues peut varier entre les dissections et dépend de la façon dont le vaisseau dorsal a été disséqué, et de la taille d’étape souhaitée entre les images. Ici, la taille de l’étape a été réglée à 0,49 mm. Ce nombre peut varier de 3 à 40 images par pile dans notre expérience.
- À l’aide d’un microscope fluorescent, utilisez le système d’interférence structurale pour produire des sections optiques du récipient dorsal. Un microscope confocal peut alternativement être utilisé qui peut fournir une précision supplémentaire. Obtenez des images de la pile Z du vaisseau dorsal à l’aide d’un logiciel d’imagerie objectif 20x et préféré. Ajoutez une barre d’échelle de 10 mm et étiquetez et enregistrez correctement les images sous forme de fichiers tiff (figure 4) ou de format souhaité.
7. Analyser les images
- Quantifier les événements fluorescents à l’aide de ImageJ.
- Ouvrez les images et empilez-les : Image à Stacks à Images to Stack.
- Comptez uniquement les signaux fluorescents de la taille d’un 10 mm d’un diamètre de 10 mm centrés sur un noyau positif au DAPI en cliquant sur chaque événement à partir d’au moins 10 cellules par mouche, à partir d’au moins 10 mouches par âge par type de particule injectée : Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figure5A). L’outil de remarque de compteur de cellules attribue une couleur différente à chaque cellule suivie, avec un point coloré qui correspond à chaque événement fluorescent cliqué sur dans cette cellule.
- Pour répertorier la position de compteur et de pile associée à chaque point, appuyez sur 'm' ou sélectionnez Mesure sous l’onglet Analyser, ou pour afficher le nombre d’événements comptés dans chaque cellule dans une table de résultats, appuyez sur 'alt +y' (Figure 5B).
- Transférez le nombre de cellules dans une feuille de calcul à utiliser pour l’analyse statistique.
- Effectuer une analyse statistique.
- Analyser les différences dans les événements phagocytiques à l’aide d’ANOVA à effets fixes ou d’ANOVA imbriqué à modèle mixte. Des modèles mixtes peuvent être utilisés pour tester les principaux effets fixes de l’âge et du génotype et l’effet aléatoire des individus imbriqués dans chaque génotype17.
REMARQUE : Les enquêteurs doivent faire des tests rigoureux pour tester les hypothèses de toute procédure statistique utilisée pour analyser les données.
- Analyser les différences dans les événements phagocytiques à l’aide d’ANOVA à effets fixes ou d’ANOVA imbriqué à modèle mixte. Des modèles mixtes peuvent être utilisés pour tester les principaux effets fixes de l’âge et du génotype et l’effet aléatoire des individus imbriqués dans chaque génotype17.
Representative Results
Pour illustrer les méthodes d’injection décrites, la figure 1A montre le site d’injection sur Drosophila melanogaster, ainsi que la façon dont le colorant alimentaire permet une confirmation visuelle que la mouche a été injectée (figure 1B). L’ajout de colorant alimentaire contribue également à la reconnaissance d’une aiguille obstruée. Les injections peuvent être effectuées dans l’abdomen, mais gardez le site d’injection cohérent entre les expériences. Cela permettra de minimiser les variations possibles entre chaque expérience.
Pour visualiser les particules étiquetées fluorescentes dans les hémocytes résidents le long du récipient dorsal, nous avons disséqué le vaisseau dorsal et la cuticule abdominale attachée. La figure 2A-F décrit les méthodes de dissection.
Pour évaluer la capacité par âge des mouches jeunes et âgées à effectuer la phagocytose, les hémocytes le long du récipient dorsal sont visualisés à l’aide d’un microscope fluorescent. Pour s’assurer que seules les cellules le long du vaisseau dorsal sont comptées, les anticorps ou les gènes marqués par GFP pour certains marqueurs de cellules sanguines ou collagènes spécifiques au cœur, tels que l’hémolectine, ou la péricardine (figure 3), respectivement, peuvent être utilisés22,23,24. Les particules fluorescentes D’E. coli mesurent 1 mm de longueur, tandis que les hémocytes mesurent 10 mm de diamètre17. Seuls les événements fluorescents situés dans un diamètre de 10 mm centré sur un noyau positif à la DAPI sont comptés (figure 4). Pour quantifier les événements fluorescents, le logiciel ImageJ est utilisé (Figure 5).
Figure 1 : Site d’injection et vérification visuelle. (A) Le côté latéral du thorax est percé d’une aiguille à capuchon tiré. (B) Les injections sont vérifiées visuellement en ajoutant du colorant alimentaire vert à la solution de particules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dissection des vaisseaux dorsaux. (A) Les broches sont placées dans le thorax et l’abdomen postérieur (flèches noires). (B-C) Deux incisions horizontales (flèches vertes) sont faites à l’extrémité postérieure de l’abdomen (B), et l’extrémité antérieure (C). (D) Une incision verticale (flèche verte) est faite au milieu de l’abdomen, reliant les deux coupes horizontales. (E) Broches facultatives (*) sont utilisées pour filet ouvrir la cavité abdominale, exposant les tissus internes. (F) Les tissus internes (culture, intestin, utérus, ovaires, corps gras) sont enlevés, exposant le vaisseau dorsal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Vue ventrale d’un récipient dorsal disséqué d’une femelle de 5 semaines injectée de particules sensibles au pH, tachée d’anticorps dirigé contre la péricardine (A). La ligne blanche pointillée trace le côté latéral du récipient dorsal, avec une flèche pointant vers la région antérieure. (B) Image agrandie de (A): grappes d’hémocytes (flèche bleue) qui dégradent activement les bactéries, dans la première chambre aortique du récipient dorsal. (C) Image agrandie de (A) décrivant la matrice extracellulaire (ECM) protéine de collagène-comme, Pericardine (flèche verte), qui maintient le récipient dorsal en place24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Vaisseau dorsal disséqué et hémocytes associés d’une mouche femelle injectée de particules sensibles au pH, ou particules fluoro. (A) Le vaisseau dorsal et les hémocytes associés à des particules E. coli sensibles au pH englouties (rouge), ou (E) fluoro-étiquetés particules E. coli (rouge), isolés d’une mouche vieille d’une semaine, après avoir récupéré pendant 60 min. (B,F) Magnifié inset de (A) et (E) (boîte blanche), respectivement, montrant deux hémocytes individuels avec des événements dénommables. (C) Le vaisseau dorsal et les hémocytes associés avec des particules E. coli sensibles au pH englouties (rouge), ou ( G) des particules E. coli (rouge) étiquetées fluoro, isolées d’une mouche vieille de 5 semaines, après avoir récupéré pendant 60 min. (D,H) Encastrés de (C) et (G) (boîte blanche), respectivement, montrant deux hémocytes individuels avec des événements dénommables. La ligne blanche pointillée trace le côté latéral du récipient dorsal, avec une flèche pointant vers la région antérieure. Noyaux tachés de DAPI (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Quantification des événements phagocytiques dans un hémocyte de 10 mm à l’aide du compteur cellulaire dans ImageJ. (A) Après ouverture de l’image(s) dans ImageJ, l’outil d’avis de compteur de cellules peut être utilisé pour suivre les événements phagocytiques par cellule. (B) Cet outil attribuera une couleur différente à chaque cellule sélectionnée à compter, chaque point correspondant à un événement fluorescent dans cette cellule. En appuyant sur 'alt+y' affiche une table indiquant le nombre d’événements comptés par cellule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Le protocole décrit ici est un moyen fiable de quantifier différents aspects de la phagocytose, dans des conditions expérimentales contrôlées. Nous notons que nous avons seulement testé cette procédure avec des particules bactériennes gram négatives et les résultats peuvent différer si des particules bactériennes gram positives sont utilisées. En effet, il serait intéressant de comparer les réponses phagocytiques aux bactéries gram négatives et gram positives dans différentes conditions expérimentales. L’utilisation d’un nano-injecteur permet un contrôle précis des volumes d’injection, assurant que chaque mouche est injectée avec le même volume de particules. L’une des limites au protocole vient des incohérences dans les préparations de particules. Les particules s’agrégent une fois congelées, de sorte que de petites variations dans les volumes de dilution, ou l’absence de vortex, peuvent affecter la concentration des particules entre les expériences. Pour minimiser les variations possibles des concentrations de particules entre les âges, il est avantageux d’injecter des mouches âgées de 1 à 5 semaines le même jour, à l’aide de la même solution d’aiguille et de particules. Un autre inconvénient potentiel est que pendant les dissections, le récipient dorsal et /ou la cuticule peuvent facilement être endommagés si les broches ne sont pas manipulées correctement. Pour éviter de perturber le récipient dorsal, réduisez au minimum le nombre de broches utilisées par dissection. L’avantage de cette méthode de dissection est que toutes les étapes de fixation, de lavage et de coloration peuvent être effectuées dans la plaque de dissection. Parce que les cuticules sont épinglées, cela empêche les cuticules d’être perdues entre les étapes.
Par rapport aux méthodes existantes18,19,25,26,27,28,29, le protocole décrit a ses avantages et ses limites. En disséquant le vaisseau dorsal, nous sommes en mesure de visualiser et de quantifier les hémocytes individuels à cet endroit. Cela permet de détecter des variations subtiles de l’activité phagocytique entre les groupes expérimentaux. D’autres méthodes visualisent les particules étiquetées fluorescentement en recueillant des hémocytes à l’aide d’un essai de bleed/scrape19,25,26,27, ou par une cuticule ventrale intacte18,19,28,29; cependant, les hémocytes individuels ne peuvent pas être évalués lorsqu’ils sont visualisés à travers la cuticule dorsale. L’avantage de ce protocole, par rapport à la méthode Bleed/Scrape est que notre méthode nous permet d’évaluer uniquement les hémocytes associés au vaisseau dorsal, et ne tenir compte des cellules circulantes ou ceux le long de la paroi du corps, qui peut être fonctionnellement différent. Disséquer le récipient dorsal supprime également la nécessité d’inclure une deuxième série d’injections avec un quencher de fluorescence, comme Trypan bleu19,26. C’est parce que toutes les particules non liées ou englouties par une cellule seront emportées pendant les étapes de lavage. Inversement, d’autres méthodes peuvent être plus faciles à exécuter parce qu’elles ne nécessitent pas de dissections. Bien que la dissection du vaisseau dorsal soit facile à apprendre, cette étape ajoute un niveau de complexité qui peut ne pas être faisable dans certaines conceptions expérimentales.
Bien que l’utilisation décrite de ce test de phagocytose in vivo soit d’évaluer et de quantifier les événements phagocytiques entre différents âges, ce protocole est très adaptable et peut être utilisé pour analyser différents aspects de la phagocytose entre le génotype, le sexe, ou le type de tissu. Avec la phagocytose étant d’une importance centrale pour la plupart des animaux multicellulaires, comprendre comment ce processus diminue avec l’âge pourrait conduire à de meilleurs traitements thérapeutiques pour la population vieillissante. Cette approche offre un potentiel à long terme pour élucider les aspects des changements liés à l’âge dans la réponse immunitaire, avec un accent particulier sur la phagocytose.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par des subventions des National Institutes of Health R03 AG061484-02 et de l’UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
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