Detta protokoll ger en enkel och tillförlitlig metod för produktion av livskraftiga precisionsskurna leverskivor från möss. Ex vivo vävnadsprover kan upprätthållas under laboratorievävnad kultur villkor för flera dagar, vilket ger en flexibel modell för att undersöka lever patobiologi.
Att förstå mekanismerna för leverskada, leverfibros och cirros som ligger bakom kroniska leversjukdomar (dvs. virushepatit, alkoholfri fettlever, metabolisk leversjukdom och levercancer) kräver experimentell manipulering av djurmodeller och in vitro-cellkulturer. Båda teknikerna har begränsningar, såsom kravet på ett stort antal djur för in vivo manipulation. Men in vitro cellkulturer reproducerar inte strukturen och funktionen av den multicellulära levermiljön. Användningen av precisionsskurna leverskivor är en teknik där enhetliga skivor av livskraftig muslever upprätthålls i laboratorievävnadskultur för experimentell manipulation. Denna teknik upptar en experimentell nisch som finns mellan djurstudier och in vitro-cellodlingsmetoder. Det presenterade protokollet beskriver en enkel och tillförlitlig metod för att isolera och odla precisionsskurna leverskivor från möss. Som en tillämpning av denna teknik, ex vivo lever skivor behandlas med gallsyror för att simulera kolestatisk leverskada och slutligen bedöma mekanismerna för lever fibrogenesis.
Patogenesen vid de flesta kroniska leversjukdomar (dvs. virushepatit, alkoholfri steatohepatit, kolastatisk leverskada och levercancer) innebär komplexa interaktioner mellan flera olika levercelltyper som driver inflammation, fibrogenes och cancerutveckling1,2. För att förstå de molekylära mekanismer som ligger till grund för dessa kroniska leverbaserade sjukdomar måste interaktionerna mellan flera levercelltyper undersökas. Medan flera lever cellinjer (och mer nyligen, organoider) kan odlas in vitro, dessa modeller inte exakt efterlikna den komplexa struktur, funktion och cellulär mångfald av lever mikromiljö3. Dessutom kan odlade leverceller (i synnerhet transformerade cellinjer) avvika från sin ursprungliga källbiologi. Djurmodeller används experimentellt för att undersöka samspelet mellan flera levercelltyper. De kan dock bli betydligt reducerade i omfattning för experimentell manipulation, på grund av betydande effekter utanför målet i extrahepatiska organ (t.ex. vid testning av potentiella terapeutiska).
Användningen av precisionsskurna leverskivor (PCLS) i vävnadskultur är en experimentell teknik som först används i läkemedelsmetabolism och toxicitetsstudier, och det innebär skärning av livskraftiga, ultratunna (cirka 100−250 μm tjocka) leverskivor. Detta möjliggör direkt experimentell manipulation av levervävnad ex vivo4. Tekniken överbryggar en experimentell klyfta mellan in vivo djurstudier och in vitro-cellodlingsmetoder, vilket övervinner många nackdelar med båda metoderna (dvs. praktiska gränser för de experimentsom kan utföras i hela djur samt förlust av struktur/funktion och cellulär mångfald med in vitro-cellodlingsmetoder).
Dessutom ökar PCLS avsevärt experimentell kapacitet jämfört med hela djurstudier. Som en mus kan producera mer än 48 leverskivor, Detta underlättar också användningen av både kontroll och behandlingsgrupper från samma lever. Dessutom separerar tekniken fysiskt levervävnaden från andra organsystem; Därför avlägsnar den potentiella effekter utanför målet som kan uppstå hos hela djur vid testning av effekterna av exogena stimuli.
I det här protokollet genereras PCLS med en vibrerande med ett sidleds vibrerande blad. Andra studier har framgångsrikt använt en Krumdieck vävnad slicer, som beskrivs i Olinga och Schuppan5. I vibratomen förhindrar sidovibrationer av bladet att riva den ultratunna vävnaden som orsakas av skjuvspänning, eftersom bladet trycks in i vävnaden. Både vibratome och Krumdieck vävnad sårskivare fungerar effektivt utan strukturell inbäddning av levervävnad, vilket effektiviserar skivningsproceduren. Denna teknik kan också användas för att skapa PCLS från sjuka lever, inklusive de från mus modeller av fibros/cirros6 och leversteatos7.
Förutom att visa de tekniker som krävs för beredning och vävnadkultur av PCLS, undersöker denna rapport också livskraften hos dessa ex vivo vävnader genom att mäta adenosin tripfosfat (ATP) nivåer och undersöka vävnad histologi för att bedöma nekros och fibros. Som ett representativt experimentellt förfarande behandlas PCLS med patofysiologiska koncentrationer av tre olika gallsyror (glykofiska, taurocholic och cholic syror) för att simulera kolastatisk leverskada. I samband med kolestatisk leverskada har särskilt taurocholicsyra visat sig vara signifikant ökad hos både serum och galla hos barn med cystisk fibros-associerade leversjukdom8.
Lever stamceller har också behandlats in vitro med taurocholic syra för att simulera de förhöjda taurocholic syra nivåer som observerats hos patienter, och denna behandling orsakade ökad spridning och differentiering av lever stamceller mot en gallan (cholangiocyte) fenotyp9. Därefter behandlades PCLS ex vivo med förhöjda nivåer av taurocholic syra, och ökade cholangiocyte markörer observerades. Detta stöder in vitro observation att taurocholic syra driver gallans spridning och / eller differentiering i samband med pediatrisk cystisk fibros-associerade leversjukdom9.
Protokollet visar tillämpningen av murine PCLS isolering och vävnad kultur, och förfarandena är utformade för att bedöma både lönsamhet och nytta samt undersöka effekterna av exogena medlare av lever patobiologi med hjälp av biokemiska analyser, histologi och qPCR. Den experimentella nyttan av PCLS-vävnadskultur hos gnagare och människor har visats i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive experimentella undersökningar i microRNA15/RNA9/protein uttryck<…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av forskningsanslag från National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (Grant No. APP1048740 och APP1142394 till G.A.R.; APP1160323 till J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm stöds av en Senior Research Fellowship från NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo stöddes av TALENTO-programmet i Madrid, Spanien (T1-BIO-1854).
10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
Protractor | Generic | To measure blade angle | |
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
Scalpel Blade | Mixed | ||
Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
Square-Head Foreceps | Mixed | ||
Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
Surgical Clamps | Mixed | ||
Surgical Forceps | Mixed | ||
Surgical Pins | Mixed | ||
Surgical Scissors | Mixed | ||
Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |