Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors
Summary
I tumori del cancro al seno umano appena ascisi sono caratterizzati da spettroscopia terahertz e imaging seguendo protocolli di manipolazione dei tessuti freschi. Il posizionamento dei tessuti viene preso in considerazione per consentire una caratterizzazione efficace, fornendo al contempo analisi in modo tempestivo per future applicazioni intraoperatorie.
Abstract
Questo manoscritto presenta un protocollo per gestire, caratterizzare e immagini tumori del seno umano appena ascisi utilizzando l’imaging terahertz pulsato e tecniche di spettroscopia. Il protocollo prevede la modalità di trasmissione terahertz a incidenza normale e la modalità di riflessione terahertz ad un angolo obliquo di 30 gradi. I dati sperimentali raccolti rappresentano impulsi del dominio temporale del campo elettrico. Il segnale del campo elettrico terahertz trasmesso attraverso un punto fisso sul tessuto asciso viene elaborato, attraverso un modello analitico, per estrarre l’indice di rifrazione e il coefficiente di assorbimento del tessuto. Utilizzando uno scanner motorio stepper, il terahertz emesso impulso viene riflesso da ogni pixel sul tumore fornendo un’immagine planare di diverse regioni del tessuto. L’immagine può essere presentata nel dominio del tempo o della frequenza. Inoltre, i dati estratti dell’indice di rifrazione e del coefficiente di assorbimento ad ogni pixel vengono utilizzati per fornire un’immagine terahertz tomografica del tumore. Il protocollo dimostra una chiara differenziazione tra tessuti cancerosi e sani. D’altra parte, non aderire al protocollo può provocare immagini rumorose o imprecise a causa della presenza di bolle d’aria e resti di liquido sulla superficie del tumore. Il protocollo fornisce un metodo per la valutazione dei margini chirurgici dei tumori al seno.
Introduction
L’imaging e la spettroscopia Terahertz (THz) sono state un’area di ricerca in rapida crescita nell’ultimo decennio. Il continuo sviluppo di emettitori THz più efficienti e coerenti nell’intervallo di 0,1-4 THz ha fatto crescere significativamente le loro applicazioni1. Un’area in cui THz ha mostrato promesse e una crescita significativa è il campo biomedico2. La radiazione THz ha dimostrato di non essere non ionizing e biologicamente sicura ai livelli di potenza generalmente utilizzati per analizzare i tessuti fissi3. Di conseguenza, l’imaging e la spettroscopia THz sono stati utilizzati per classificare e differenziare varie caratteristiche dei tessuti come il contenuto di acqua per indicare danni da ustione e guarigione4, cirrosi epatica5e cancro nei tessuti ascisi6,7. La valutazione del cancro copre in particolare una vasta gamma di potenziali applicazioni cliniche e chirurgiche, ed è stata studiata per i tumori del cervello8, fegato9, ovaie10, tratto gastrointestinale11, e seno7,12,13,14,15,16,17,18,19.
Le applicazioni THz per il cancro al seno si concentrano principalmente sul supporto della chirurgia conservativa del seno, o lumpectomia, tramite la valutazione del margine. L’obiettivo di una lumpectomia è quello di rimuovere il tumore e un piccolo strato di tessuto sano circostante, in contrasto con la mastectomia completa, che rimuove l’intero seno. Il margine chirurgico del tessuto asciso viene quindi valutato tramite patologia una volta che il campione è stato fissato in formalina, sezionato, incorporato in paraffina, e montato in 4 fette di m-5 su vetrini al microscopio. Questo processo può richiedere molto tempo e richiede una procedura chirurgica secondaria in un secondo momento se si osserva un margine positivo20. Le attuali linee guida dell’American Society of Radiation Oncology definiscono questo margine positivo come avere cellule tumorali che contattano l’inchiostro margine a livello superficiale21. L’imaging THz per tessuto idratato ad alto assorbimento è principalmente limitato all’imaging superficiale con una penetrazione variabile in base al tipo di tessuto, che è sufficiente per soddisfare le esigenze chirurgiche di valutazione rapida del margine. Una rapida analisi delle condizioni di margine durante l’impostazione chirurgica ridurrebbe notevolmente i costi chirurgici e il tasso di procedura di follow-up. Ad oggi, THz si è dimostrato efficace nel differenziare tra il cancro e il tessuto sano nei tessuti fissati in formalina, incorporati in paraffina (FFPE), ma sono necessarie ulteriori indagini per fornire un rilevamento affidabile del cancro nei tessuti appena assordati7.
Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per l’esecuzione di imaging THz e spettroscopia su campioni di tessuto umano appena eccitati ottenuti da una biobanca. Le applicazioni THz basate su tessuti di cancro al seno umano appena eccitati sono stati raramente utilizzati nella ricerca pubblicata7,18,22,23, soprattutto da gruppi di ricerca non integrati con un ospedale. L’uso di tessuti appena eccitati è altrettanto raro per altre applicazioni tumorali, con la maggior parte degli esempi di cancro umano non-seno essere segnalati per il cancro colonico24,25. Uno dei motivi è che i blocchi di tessuto FFPE sono molto più facili da raggiungere e gestire rispetto al tessuto appena assornato a meno che il sistema THz utilizzato per lo studio non faccia parte del flusso di lavoro chirurgico. Allo stesso modo, la maggior parte dei sistemi THz di laboratorio commerciale non sono preparati per gestire i tessuti freschi, e quelli che lo fanno sono ancora nelle fasi di utilizzo della crescita della linea cellulare o hanno solo iniziato a guardare il tessuto ascisato da modelli animali. Per applicare tHz a un’impostazione intraoperatoria è necessario sviluppare in anticipo le fasi di imaging e caratterizzazione per i tessuti freschi in modo che l’analisi non interferisca con la capacità di eseguire patologie standard. Per le applicazioni che non sono intrinsecamente destinate ad essere intraoperatorie, la caratterizzazione del tessuto fresco è ancora un passo impegnativo che deve essere affrontato per lavorare verso applicazioni in vivo e differenziazione.
L’obiettivo di questo lavoro è quello di fornire una linea guida per l’applicazione THz per i tessuti appena asbici utilizzando un sistema THz commerciale. Il protocollo è stato sviluppato su un sistema di imaging e spettroscopia THz26 per tumori del cancro al seno murini13,17,19 ed è stato esteso al tessuto chirurgico umano ottenuto dalle biobanche7,18. Mentre il protocollo è stato generato per il cancro al seno, gli stessi concetti possono essere applicati a sistemi di imaging THz simili e ad altri tipi di tumori del tumore solido che vengono trattati con chirurgia dove il successo dipende dalla valutazione del margine27. A causa di una quantità piuttosto piccola di risultati THz pubblicati sui tessuti appena eccitati, questo è il primo lavoro alle conoscenze degli autori per concentrarsi sul protocollo di movimentazione dei tessuti freschi per l’imaging e la caratterizzazione THz.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’acquisizione efficace di una riflessione THz del tessuto fresco dipende principalmente da due aspetti critici: 1) la corretta considerazione della manipolazione dei tessuti (sezioni 2 e 4,15); e 2) la messa a punto (principalmente sezione 4.11). Un’essiccazione insufficiente del tessuto può provocare una maggiore riflessione e incapacità di visualizzare le regioni a causa di alte riflessioni di DMEM e altri fluidi. Nel frattempo, un cattivo contatto dei tessuti con la finestra di imaging crea anelli o macchie di bass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Premio National Institutes of Health (NIH) – R15CA208798 e in parte dal National Science Foundation (NSF) Award – 1408007. I finanziamenti per il sistema THz pulsato sono stati ottenuti tramite il premio NSF/MRI n. 1228958. Riconosciamo l’uso di tessuti acquistati dall’NDRI (National Disease Research Interchange) con il sostegno della sovvenzione NIH U42OD11158. Riconosciamo anche la collaborazione con Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory presso l’Oklahoma State University per condurre la procedura di istopatologia su tutti i tessuti gestiti in questo lavoro.
Materials
| 70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
| Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
| Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
| Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
| Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
| Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
| Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
| Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
| Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
| Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
| Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
| Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
| IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
| KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
| Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
| Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
| Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
| Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
| Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
| Paper towel | VWR | 14222-321 | 11 x 8.78" Sheets, 1 Ply |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
| Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
| Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
| ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
| Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
| Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
| Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
| TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
| TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |
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