Flödescytometrianalys av immuncellsdelmängder inom Murine Mjälte, Benmärg, Lymfkörtlar och synovial vävnad i en artrosmodell
Summary
Här beskriver vi en detaljerad och reproducerbara flöde cytometry protokollet för att identifiera monocyte/macrophage och T-cells delmängder med hjälp av både extra- och intracellulära färgning assays inom murine mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad, utnyttja en etablerad kirurgisk modell av murine artros.
Abstract
Artros (OA) är en av de vanligaste muskuloskeletala sjukdomar, som drabbar patienter som lider av smärta och fysiska begränsningar. Nya bevis tyder på en potentiell inflammatorisk komponent av sjukdomen, med både T-celler och monocyter/makrofager potentiellt samband med patogenesen vid OA. Ytterligare studier postulerade en viktig roll för undergrupper av både inflammatoriska cell härstamningar, såsom Th1, Th2, Th17, och T-reglerande lymfocyter, och M1, M2, och synovium-vävnad-resident makrofager. Men interaktionen mellan den lokala synovial och systemiska inflammatoriska cellulära svar och de strukturella förändringarna i leden är okänd. För att till fullo förstå hur T-celler och monocyter/makrofager bidrar mot OA är det viktigt att kunna identifiera dessa celler och deras undergrupper på ett quantitively sätt att identifiera dessa celler och deras undermängder samtidigt i synovial vävnad, sekundära lymfatiska organ och systemiskt (mjälten och benmärgen). Numera kan de olika inflammatoriska cell delmängderna identifieras genom en kombination av cell-ytan markörer gör multi-color flow cytometry en kraftfull teknik för att undersöka dessa cellulära processer. I detta protokoll beskriver vi detaljerade steg angående skörden av synovial vävnad och sekundära lymfatiska organ samt generering av single cell suspensioner. Vidare presenterar vi både en extracellulära färgning assay att identifiera monocyter/makrofager och deras undergrupper samt en extra- och intra-cellulära färgning assay att identifiera T-celler och deras undergrupper inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad. Varje steg i detta protokoll var optimerad och testade, vilket resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan utnyttjas för andra kirurgiska och icke-kirurgiska OA mus modeller.
Introduction
Artros (OA) är en försvagande och smärtsam sjukdom som involverar olika patologier av alla vävnader som är associerade med leden1. Påverkar cirka 3,8% av den globalabefolkningen 2, OA är en av de vanligaste muskuloskeletala sjukdomar och det är att bliden 4 ledande orsaken till funktionshinder i världen 20203. Posttraumatisk OA inträffar efter en ledskada och svarar för minst 12% av alla OA och upp till 25% av OA i mottagliga leder såsomknäet 4,5. Vidare ökar ledskadan livstidsrisken för OA med mer än fem gånger6. Inte alla skador med till synes liknande instabilitet kommer att fortsätta att utveckla OA, och därför definiera faktorer som driver den långsiktiga OA-risken är fortfarande utmanande. Det är avgörande för att utveckla effektiva behandlingar för att förebygga och/eller behandla posttraumatisk OA, att undersöka och bättre definiera de skadespecifika patologi, orsaker, och mekanismer som predisponerar för OA1.
OA och dess definierande brosk förstörelse var tidigare helt tillskrivas mekanisk stress och, därmed, OA ansågs vara en icke-inflammatorisk sjukdom2. Emellertid, nyare studier har visat en inflammatorisk infiltration av synovial membran och en ökning av inflammatoriska celler i synovial vävnad hos patienter med OA jämfört med friska kontroller2, sprider ljus på en inflammatorisk komponent som en potentiell drivkraft i OA. Ytterligare studier indikerade att avvikelser i både CD4+ och CD8+ T-cellprofilen samt monocyter/makrofager i det medfödda immunsystemet kan bidra till patogenesen vid OA2,7. Detaljerade undersökningar av dessa avvikelser visade relevanta roller för olika T-cell delmängder2, såsom Th18, Th29, Th178 och T reglerande (Treg)populationer 10,11. Trots detta övertygande bevis, orsakssamband mellan förändringen av T-cells svar och utveckling och progression av OA är fortfarande okänd2.
Förutom specifika T-celler som har en roll i OA, aktuella studier tyder på att differentially polariserade / aktiverade makrofager kan vara förknippade med patogenes av OA12. I synnerhet makrofager som härrör från blodmonocyter ackumuleras i synovium och polarisera till antingen klassiskt aktiverade makrofager (M1) eller alternativt aktiverade makrofager (M2) under OA utveckling, vilket innebär en korrelation mellan monocyter härledda makrofager och OA13. Däremot vissa undergrupper av makrofager befolka organ tidigt under utveckling och själv upprätthålla deras antal i en monocyt oberoende fråga14. Nyligen visades en gemensam skyddsfunktion som förmedlades av en tät korsning barriär för dessa synovial-vävnad-resident makrofager (STRMs)14. Dessa resultat tyder på att avvikelser i synnerhet makrofag delmängder kan spela en avgörande roll under utvecklingen av OA. Men, samspelet mellan denna inflammatoriska cellulära svar och de strukturella förändringarna i den gemensamma efter trauma är okänd.
Historiskt, analys av immunceller i synovialvävnaden var begränsad till immunohistokemi (IHC) eller mRNA uttryck genom omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR)närmar 15,16. Men, både IHC och RT-PCR saknar förmågan att identifiera flera olika celltyper och deras underuppsättningar samtidigt, alltså, begränsa tillämpligheten av dessa metoder. Vidare, IHC är begränsad till analys av små prover av vävnad och kan missa fokala inflammatoriska cell ansamlingar. Under de senaste åren har en myriad av ytmarkörer för olika celltyper utvecklats, och delmängder av immunceller kan nu identifieras på ett tillförlitligt sätt genom distinkta kombinationer av dessa markörer. På grund av stadiga tekniska framsteg, flöde cytometrar är nu kan identifiera en mängd olika fluorokromer samtidigt möjliggöra analys av stora multicolor antikroppar paneler.
Flödescytometri ger utredarna en kraftfull teknik som möjliggör samtidig identifiering och kvantifiering av en mängd immunceller och deras undergrupper på singelcellsnivå. Vi har utvecklat och optimerat både en extracellulär färgningsanalys för att identifiera monocyter/makrofager och deras undergrupper samt en extra/intracellulär fläckningsanalys för att identifiera T-celler och deras undergrupper inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad. Varje steg i detta protokoll var optimerad och testade resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan utnyttjas för andra kirurgiska och icke-kirurgiska OA mus modeller17.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs i detta protokoll har utformats och testats för att på ett tillförlitligt sätt identifiera olika undergrupper från både monocyter/makrofager och T-celler inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad i en murin modell av artros (OA). Det aktuella protokollet kan enkelt modifieras för att undersöka olika vävnadstyper, eller andra celltyper genom att utbyta antikroppar, och kan användas för alternativa murinmodeller av OA. Vid testning av andra vävnadstyper är det vikt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Andrew Lim, Ph.D. och Giles Best, Ph.D. för deras hjälp med att inrätta flödescytometern. Detta projekt fick stöd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) som tilldelats PH.
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints–analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
