Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for kvantitativ bestemmelse af palmitoyllation af hjernemembranproteiner
Summary
Palmitovlation indebærer inkorporering af en 16-carbon palmitat moiety til cysteinrester af målproteiner på en reversibel måde. Her beskriver vi en biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay, at undersøge palmitoylering tilstand af ethvert protein af interesse i mus hjerne lysates.
Abstract
Aktivitetsafhængige ændringer i niveauet af synaptiske AMPA-receptorer (AMPARs) inden for postsynaptisk tæthed (PSD) menes at repræsentere en cellulær mekanisme til læring og hukommelse. Palmitoplation regulerer lokalisering og funktion af mange synaptiske proteiner, herunder AMPA-R’er, hjælpefaktorer og synaptiske stilladser på en aktivitetsafhængig måde. Vi identificerede synapse differentiering induceret gen (SynDIG) familie af fire gener (SynDIG1-4) kodning hjerne-specifikke transmembranproteiner, der forbinder med AMPARs og regulere synapse styrke. SynDIG1 palmitoladeres ved to cysteinrester på position 191 og 192 i den sideløbende transmembrane-region, der er vigtig for aktivitetsafhængig ekstuponitory synapseudvikling. Her beskriver vi en innovativ biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay, at undersøge palmitoylering tilstand af ethvert protein af interesse og demonstrere dens nytte med SynDIG familie af proteiner i musehjerne lysates.
Introduction
S-palmitovlation er en reversibel posttranslationel ændring af målproteiner, der regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraktioner1. Det indebærer tilsætning af en 16-carbon palmitatmoiety til cysteinrester via thioester kobling katalyseret af palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitolaated, herunder AMPA-Rs og PSD-95, i en aktivitetsafhængig måde at regulere stabilitet, lokalisering, og funktion2,3,4. Ændringer i niveauet af synaptiske AMPARs i PSD via interaktion mellem hjælpefaktorer med synaptiske stilladser såsom PSD-95 ligger til grund for synaptisk plasticitet; således giver metoder til bestemmelse af synaptiske proteiners palmitotolationstilstand vigtig indsigt i mekanismer for synaptisk plasticitet.
Tidligere identificerede vi SynDIG-familien på fire gener (SynDIG1-4), der koder hjernespecifikke transmembranproteiner, der forbinder med AMPARs5. Overekspression eller knock-down af SynDIG1 i dissociated rotte hippocampal neuroner stiger eller falder, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og antal med ~ 50% som opdaget ved hjælp af immuncytokemi og elektrofysiologi5. Vi udnyttede acyl-biotin-vekslingen (ABE) til at vise, at SynDIG1 palmitoladeres ved to bevarede sammentædningscycycysrester (findes i alle SynDIG-proteiner) på en aktivitetsafhængig måde for at regulere stabilitet, lokalisering og funktion6. ABE-analysen er baseret på udveksling af biotin på cysteiner, der er beskyttet af ændringer og efterfølgende affinitetsrensning7. Her beskriver vi en innovativ biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay8,9,10,11,12, som ikke kræver affinitet rensning og i stedet udnytter ændringer i gel mobilitet til at bestemme antallet af ændringer for et protein af interesse. Protokollen er beskrevet til undersøgelse af endogene membranproteiner fra musehjernen, for hvilke der findes egnede antistoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vores tidligere arbejde, vi udnyttede ABE analyse til at vise, at SynDIG1 er palmitoyleret på to bevarede sammenstilling-transmembrane Cys rester (findes i alle SynDIG proteiner) i en aktivitetsafhængig måde at regulere stabilitet, lokalisering, og funktion6. En begrænsning er, at ABE-analysen kræver affinitetsrensning med agaroseharpikser, der er konjugeret til avidin moieties som det sidste trin i proceduren, hvilket resulterer i et betydeligt tab af signal, der komplicerer den kvantitati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker K. Woolfrey for rådgivning og input på APEGS assay. Disse undersøgelser blev finansieret af forskningsbevillinger til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
