Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten
Summary
Palmitoylation houdt de integratie in van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïneresiduen van doelproteïnen op een omkeerbare manier. Hier beschrijven we een biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van een eiwit van belang in muis hersenen lysaten te onderzoeken.
Abstract
Activiteitsafhankelijke veranderingen in de niveaus van synaptische AMPA-receptoren (AMPARs) binnen de postsynaptische dichtheid (PSD) wordt beschouwd als een cellulair mechanisme voor leren en geheugen. Palmitoylation regelt lokalisatie en functie van vele synaptische eiwitten, waaronder AMPA-R’s, hulpfactoren en synaptische steigers op een activiteitsafhankelijke manier. We identificeerden de synapsdifferentiatie geïnduceerde gen (SynDIG) familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs en synapssterkte reguleren. SynDIG1 is palmitoylated bij twee cysteïneresiduen die zich op posities 191 en 192 in het nevenxta-transmembraangebied bevinden dat belangrijk is voor activiteitsafhankelijke excitatory synapsenontwikkeling. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van elk eiwit van belang te onderzoeken en het nut ervan aan te tonen met de SynDIG familie van eiwitten in muis hersenen lysaten.
Introduction
S-palmitoylation is een omkeerbare post-translationele modificatie van doeleiwitten die stabiele membraanassociatie, eiwithandel en eiwit-eiwitinteracties reguleert1. Het gaat om toevoeging van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïne residuen via thioester linkage gekatalyseerd door palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymen. Veel synaptische eiwitten in de hersenen zijn palmitoylated, met inbegrip van AMPA-R’s en PSD-95, op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie, en functie2te reguleren,3,4. Veranderingen in de niveaus van synaptische AMPARs in de PSD via interactie van hulpfactoren met synaptische steigers zoals PSD-95 liggen ten grondslag aan synaptische plasticiteit; methoden om de palmitoylation-toestand van synaptische eiwitten te bepalen, bieden dus belangrijk inzicht in mechanismen van synaptische plasticiteit.
Eerder identificeerden we de SynDIG-familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs5. Overexpressie of knock-down van SynDIG1 in gescheiden rat hippocampal neuronen neemt toe of vermindert, respectievelijk, AMPA-R synapsgrootte en aantal met ~ 50% zoals gedetecteerd met behulp van immunocytochemie en elektrofysiologie5. We gebruikten de acyl-biotine uitwisseling (ABE) test om aan te tonen dat SynDIG1 is palmitoylated op twee geconserveerde nevennoa-transmembraan Cys residuen (gevonden in alle SynDIG eiwitten) op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit te reguleren, lokalisatie, en functie6. De ABE-test is gebaseerd op de uitwisseling van biotine op cysteïnen beschermd door modificatie en daaropvolgende affiniteitzuivering7. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische aanpak, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test8,9,10,11,12, die geen affiniteit zuivering vereist en in plaats daarvan maakt gebruik van veranderingen in gel mobiliteit om het aantal wijzigingen voor een eiwit van belang te bepalen. Het protocol wordt beschreven voor onderzoek naar endogene membraaneiwitten uit muizenhersenen waarvoor geschikte antilichamen beschikbaar zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
In ons vorige werk gebruikten we de ABE-test om aan te tonen dat SynDIG1 palmitoylated is op twee geconserveerde nevenprovliecys-residuen (gevonden in alle SynDIG-eiwitten) op een activiteitsafhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie en functie te reguleren6. Een beperking is dat de ABE-test affiniteitszuivering vereist met agaroseharsen die tot avidin moieties worden vervoegd als de laatste stap in de procedure, wat resulteert in een aanzienlijk verlies van signaal dat kwantitatieve analyse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken K. Woolfrey voor advies en input op de APEGS-test. Deze studies werden gefinancierd door onderzoekssubsidies aan E.D. van de Whitehall Foundation en de NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
