Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analyse for kvantitativ bestemmelse av palmitoylering av hjernemembranproteiner
Summary
Palmitoylation innebærer inkorporering av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester av målproteiner på en reversibel måte. Her beskriver vi en biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av ethvert protein av interesse for mus hjernen lysates.
Abstract
Aktivitetsavhengige endringer i nivåene av synaptiske AMPA-reseptorer (AMPARs) innenfor den postsynaptiske tettheten (PSD) antas å representere en cellulær mekanisme for læring og minne. Palmitoylation regulerer lokalisering og funksjon av mange synaptiske proteiner, inkludert AMPA-Rs, hjelpefaktorer og synaptiske stillas på en aktivitetsavhengig måte. Vi identifiserte synapsedifferensieringsindusertgen (SynDIG) av fire gener (SynDIG1-4) koding hjernespesifikke transmembrane proteiner som forbinder med AMPARs og regulerer synapsestyrke. SynDIG1 er palmitoylated ved to cysteinrester som ligger i stillinger 191 og 192 i den juxta-transmembrane regionen viktig for aktivitetsavhengig spenningssynapse utvikling. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av noe protein av interesse og demonstrere sin nytte med SynDIG familien av proteiner i mus hjernen lysates.
Introduction
S-palmitoylering er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av målproteiner som regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraksjoner1. Det innebærer tillegg av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester via thioester linkage katalysert av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitoylert, inkludert AMPA-Rs og PSD-95, på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon2,3,4. Endringer i nivåene av synaptiske AMPARs i PSD via interaksjon av hjelpefaktorer med synaptiske stillas som PSD-95 ligger til grunn for synaptisk plastisitet; dermed gir metoder for å bestemme palmitoyleringstilstanden til synaptiske proteiner viktig innsikt i mekanismer for synaptisk plastisitet.
Tidligere identifiserte vi SynDIG-familien med fire gener (SynDIG1-4) koding av hjernespesifikke transmembranproteiner som forbinder med AMPARs5. Overexpression eller knock-down av SynDIG1 i dissosierte rotte hippocampal nevroner øker eller reduseres, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og nummer med ~ 50% som detektert ved hjelp av immuncytokjemi og elektrofysiologi5. Vi benyttet acyl-biotin utveksling (ABE) analyse for å vise at SynDIG1 er palmitoylated på to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering, og funksjon6. ABE-analysen er avhengig av utveksling av biotin på cysteiner beskyttet av modifikasjon og påfølgende affinitetsrensing7. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse8,9,10,11,12, som ikke krever affinitet rensing og i stedet benytter endringer i gel mobilitet for å bestemme antall modifikasjoner for et protein av interesse. Protokollen er beskrevet for undersøkelse av endogene membranproteiner fra musehjernen som egnede antistoffer er tilgjengelige for.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vårt tidligere arbeid benyttet vi ABE-analysen til å vise at SynDIG1 er palmitoylated ved to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon6. En begrensning er at ABE-analysen krever affinitetsrensing med agaroseharpikser som konjugeres til avidin moieties som det siste trinnet i prosedyren, noe som resulterer i betydelig tap av signal som kompliserer kvantitativ analyse. Videre ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker K. Woolfrey for råd og innspill på APEGS-analysen. Disse studiene ble finansiert av forskningstilskudd til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
