In situ Hybridisering för Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv in situ hybridisering metod för att upptäcka mRNA uttryck nivåer och rumsliga mönster av målgener i Sipunculus nudus coelomic vätska.
Abstract
In situ hybridisering (ISH) är en mycket informativ teknik för att presentera cellulära distributionsmönster av specifika gener (t.ex. mRNA och ncRNA) i vävnader. Den sipunculid mask Sipunculus nudus är en avgörande fiske resurs eftersom den har höga näringsmässiga och medicinska värden. För närvarande är forskningen om molekylärbiologi Sipunculus nudus fortfarande i sin linda. Syftet med denna artikel är att utveckla en känslig metod för att lokalisera specifika mRNA i Sipunculus nudus coelomic vätska. Protokollet innehåller detaljerade steg av ISH, inklusive digoxigenin-märkt antisense och känsla riboprobe beredning, coelomic vätska insamling och avsnitt beredning, specifika riboprobe hybridisering, antikroppar inkubation, färgning och efter färgning behandlingar. De representativa resultat som erhållits från ett lyckat experiment med denna metod visas. Protokollet bör också tillämpas på andra Sipuncula-arter.
Introduction
ISH, med hjälp av en märkt nukleinsyrsond för att upptäcka den specifika DNA- eller RNA-sekvensen av intresse, är en användbar metod för att beskriva det rumsliga uttrycksmönstret för målgener i morfologiskt konserverade vävnader1,,2,3. Normalt genereras målsekvensen av polymeraskedjereaktion (PCR), och används sedan som mall för att syntetisera antisense/sense RNA-sonden märkt med digoxigeninuridin-5′-triphosphate. Proverna är fixerade och permeabiliserade före inkubation med ribosonbe. Efter tvättning av överskottssonden visualiseras hybridiseringen av immunohistokemi med hjälp av en anti-digoxygeninantikropp, som är alkalisk fosfataskonjugerad3,,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; beställ Sipunculida: Sipunculidae) är en osegmenterad, coelomate och bilateralt symmetrisk marin mask7,8. Sipunculus nudus är en kosmopolitisk art som är utbrett i tropiska och tempererade kustvatten. Det är också en viktig marin fiskeriresurs i södra Kina på grund av dess höga närings- och medicinska värden9,,10. Sipunculus nudus i molekylärbiologi är dock fortfarande i sin linda. För att till fullo förstå genernas biologiska roll är undersökningen av geners uttrycksmönster vid en cellupplösning av stort intresse. I icke-modellorganismen Sipunculus nudushar ISH-metoden, som är en idealisk metod för att upptäcka genuttrycksmönstren, ännu inte fastställts. Dess coelomic vätska innehåller flera celltyper, inklusive granulocyter, urnceller, vesikulära celler, könsceller, erytrocyter, etc11. Den dubbla kön/mab-3 relaterade transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), som används som en representativ gen i denna metod, är en mycket bevarad transkriptionsregulator för könsbestämning och differentiering hos de flesta arter som sträcker sig från ryggradslösa djur till däggdjur12,13. I en rad olika arter (dvs. svart porgy, etc.) 14, dmrt1 uttrycktes i Sertoli celler, som omger könsceller, vars funktion liknar trofoblast celler av Sipunculus nudus. Därför hypotesen vi att dmrt1 av Sipunculus nudus uttrycks i trophoblast celler av spermatozeugmata, och resultatet av ISH metoden bekräftade tydligt hypotesen.
Detta protokoll för första gången beskriver ISH, med digoxigenin-märkt antisense/sense mRNA sonder, att bestämma mRNA uttryck mönster i sin coelomic vätska utstryk. De optimala reaktionsförhållandena levereras, vilket möjliggör mycket känslig visualisering av mRNA-uttryck vid hög upplösning. Den utvecklade ISH-metoden skulle kunna tillämpas på fler sipunculida arter än Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare studier visade att ISH är lämplig för att upptäcka flera mål RNA16,17,18. I detta protokoll beskrev vi en högupplöst ISH-metod för att upptäcka mRNA i coelomic vätska och betona optimerade hybridisering villkor i Sipunculus nudus. De uppenbara signalerna från dmrt1 vi observerade visade en framgångsrik tillämpning av detta protokoll vid påvisande av genuttryck (figur …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J01161), Scientific Research Funds of Huaqiao University (15BS306) och Postgraduates Innovative Fund in Scientific Research of Huaqiao University.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O’Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
