Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Summary
Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.
Abstract
La hibridación in situ (ISH) es una técnica muy informativa para presentar patrones de distribución celular de genes específicos (por ejemplo, ARNm y NCRNA) en los tejidos. El gusano sipunculid Sipunculus nudus es un recurso pesquero crucial, ya que tiene altos valores nutricionales y medicinales. Actualmente, la investigación sobre la biología molecular de Sipunculus nudus todavía está en su infancia. El propósito de este artículo es desarrollar un método sensible para localizar un ARNm específico en sipunculus nudus líquido celómico. El protocolo incluye pasos detallados de la ISH, incluyendo la preparación de ribosondas con nombre digoxigenina y de sentido, la recolección de fluidos celómicos y la preparación de secciones, la hibridación ribosondas específicas, la incubación de anticuerpos, la coloración y los tratamientos posteriores a la coloración. Se muestran los resultados representativos obtenidos de un experimento exitoso con este método. El protocolo también debe ser aplicable a otras especies de Sipuncula.
Introduction
Ish, utilizando una sonda de ácido nucleico etiquetada para detectar la secuencia específica de ADN o ARN de interés, es un método útil para describir el patrón de expresión espacial de genes diana en tejidos morfológicamente preservados1,2,3. Normalmente, la secuencia diana es generada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego se utiliza como plantilla para sintetizar la sonda de ARN antisentido/sentido etiquetada con digoxigenina uridina-5′-trifosfato. Las muestras se fijan y permeabilizan antes de la incubación con ribosondas. Después de lavar el exceso de sonda, la hibridación es visualizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina, que es fosfatasa alcalina conjugada3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; order Sipunculida: Sipunculidae) es un gusano marino no segmentado, coelomate y bilateralmente simétrico7,8. Sipunculus nudus es una especie cosmopolita ampliamente distribuida en aguas costeras tropicales y templadas. También es un importante recurso pesquero marino en el sur de China debido a sus altos valores nutricionales y medicinales9,,10. Sin embargo, Sipunculus nudus en biología molecular todavía está en su infancia. Para entender plenamente el papel biológico de los genes, la investigación de los patrones de expresión de genes a una resolución celular es de gran interés. En el organismo no modelo Sipunculus nudus, el método ISH, que es un método ideal para detectar los patrones de expresión de genes, aún no se ha establecido. Su líquido celómico contiene varios tipos de células, incluyendo granulocitos, células de urna, células vesiculares, células germinales, eritrocitos, etc11. El doble factor de transcripción relacionado con el sexo/mab-3(dmrt1),utilizado como gen representativo en este método, es un regulador transcripcional altamente conservado de la determinación y diferenciación del sexo en la mayoría de las especies que van desde invertebrados hasta mamíferos12,,13. En una gama de especies (es decir, porgy negro, etc.) 14, dmrt1 se expresó en las células sertoli, rodeando las células germinales, cuya función es similar a las células trofoblastos de Sipunculus nudus. Por lo tanto, hipotetizaron que dmrt1 de Sipunculus nudus se expresa en células trofoblastos de espermatozoides, y el resultado del método ISH confirmó claramente la hipótesis.
Este protocolo describe por primera vez la ISH, con sondas de ARNm antisentido/sentido con etiqueta digoxigenina, para determinar los patrones de expresión de ARNm en su frotis de fluido coelómico. Se proporcionan las condiciones óptimas de reacción, que permiten una visualización muy sensible de la expresión de ARNm a alta resolución. El método ISM desarrollado podría aplicarse potencialmente en más especies de Sipunculida distintas de Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudios anteriores mostraron que la ISH es adecuada para detectar múltiples ARN objetivo16,17,18. En este protocolo, describimos un método ISH de alta resolución para detectar el ARNm en fluido celómico y enfatizar las condiciones de hibridación optimizadas en Sipunculus nudus. Las señales obvias de dmrt1 que observamos demostraron la aplicación exitosa de este protocolo en la detección de la expresió…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Beca No. 31801034), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2016J01161), los Fondos de Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao (15BS306) y el Fondo Innovador de Posgrados en Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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