फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कॉममेंसल बैक्टीरिया के लिए बाध्यकारी मानव नोरोवायरस वायरस जैसे कणों की मात्रा
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य बैक्टीरिया के लिए यूकेरियोटिक रोगजनक मानव नोरोवायरस के बाध्यकारी की मात्रा निर्धारित करना है। एक प्रारंभिक वायरस-जीवाणु लगाव परख प्रदर्शन करने के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री आबादी के भीतर वायरल से बंधे बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
कॉममेंसल बैक्टीरिया अच्छी तरह से यूकेरियोटिक वायरस के संक्रमण को प्रभावित करने के लिए स्थापित किए जाते हैं। रोगजनक और मेजबान माइक्रोबायोम के बीच सीधा बाध्यकारी इनमें से कई वायरस के लिए संक्रमण में फेरबदल के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, वायरस-बैक्टीरिया बाध्यकारी की प्रकृति की विशेषता तंत्र (ओं) को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक एक मूलभूत कदम है जिसके द्वारा बैक्टीरिया वायरल संक्रमण को बदल देते हैं। ह्यूमन नोरोवायरस के लिए कॉममेंसल बैक्टीरिया बी सेल इंफेक्शन को बढ़ाते हैं। वायरस सीधे इन बैक्टीरिया से बांधता है, जो यह दर्शाता है कि यह सीधी बातचीत संक्रमण वृद्धि के तंत्र में शामिल है। रेडियोलेबल वायरस और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) की प्रस्फुटन गिनती सहित बैक्टीरिया और वायरस के बीच बातचीत की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। दोनों तरीकों के लिए जीका वायरस के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिसे प्रयोगशाला में उत्पन्न करने की आवश्यकता हो सकती है। वर्तमान में, मानव नोरोवायरस के लिए उपलब्ध स्थापित इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में से कोई भी अत्यधिक केंद्रित वायरल स्टॉक की पीढ़ी के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है। जीका वायरस के बदले वायरस जैसे कणों (वीएलपी) का इस्तेमाल नोरोवायरस और बैक्टीरिया के बीच होने वाली बातचीत को चिह्नित करने के लिए किया गया है। इसके साथ एक प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग करता है वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ वर्णित है जो ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए वीएलपी बाध्यकारी है। परीक्षण किए गए बैक्टीरिया के लिए वीएलपी लगाव की पृष्ठभूमि एंटीबॉडी बाध्यकारी और सटीक मात्रा को कम करने के लिए परख के अनुकूलन के लिए केवल बैक्टीरिया और आइसोटाइप नियंत्रण दोनों को शामिल करना। उच्च वीएलपी: जीवाणु अनुपात में बैक्टीरियल आबादी के बड़े प्रतिशत के लिए बाध्यकारी वीएलपी में परिणाम है । हालांकि, जब वीएलपी की मात्रा में कमी आती है, तो बंधे बैक्टीरिया का प्रतिशत भी कम हो जाता है । अंततः, इस विधि को भविष्य के प्रयोगों में नियोजित किया जा सकता है जो विशिष्ट स्थितियों और संरचनात्मक घटकों को स्पष्ट करते हैं जो नोरोवायरस को विनियमित करते हैं: बैक्टीरियल इंटरैक्शन।
Introduction
मानव नोरोवायरस (HuNoVs) दुनिया भर में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल बीमारी का प्रमुख कारण हैं, जो हरसाल685 मिलियन संक्रमणों और 200,000 से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार हैं। अन्य आंत्र वायरस के साथ, इस रोगजनक के संक्रमण के साथ-साथ इसके सरोगेट वायरस, मूत्र नोरोवायरस2,,3के संक्रमण को बढ़ाने के लिए कॉममेंसल बैक्टीरिया की उपस्थिति दिखाई गई है। ऐसी भी परस्पर विरोधी खबरें हैं कि बैक्टीरिया मानव नोरोवायरस4,5,,6द्वारा संक्रमण को बाधित कर सकते हैं । कई वायरसों के लिए, वायरस और बैक्टीरिया के बीच सीधी बातचीत वायरल संक्रमण,2,,,7,8,9,10को प्रभावित करने वाले तंत्रों को रेखांकित करती दिखाई देती है, और इसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दिखाया गया है कि मानव नोरोवायरस सीधे बैक्टीरिया11,,12की सतहों से बांधते हैं।9 इसलिए, इन बातचीत की विशेषता तंत्र है जिसके द्वारा बैक्टीरिया वायरल संक्रमण प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । यह लक्षण वर्णन शास्त्रीय रूप से शुरू हो गया है , जो जीवाणु प्रजातियों की एक सरणी के लिए वायरल बाध्यकारी है जो मेजबान माइक्रोबायोम7,12,13के घटक हैं ।13 इन लगाव परख ों से न केवल बैक्टीरिया से बंधे वायरस की मात्रा का पता चलता है, बल्कि वायरल फिटनेस और अस्तित्व पर इस बातचीत के प्रभाव का निर्धारण करने में भी सहायता करते हैं ।
वायरल लगाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पारंपरिक रूप से नियोजित तरीकों में पीसीआर आधारित परख शामिल हैं जो वायरल जीनोम12 या रेडियोलेबल वायरस की पीढ़ी और वायरल कणों7,88,99,13की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रस्फुटन गिनती का उपयोग निर्धारित करते हैं ।, इन तरीकों के उपयोग के लिए आम तौर पर उच्च टिटर वायरस स्टॉक और इन विट्रो खेती तकनीकों तक पहुंच की आवश्यकता होती है जिसके साथ उन्हें उत्पन्न करना होता है। जबकि मानव नोरोवायरस के लिए कई संस्कृति प्रणालियां अब2,,14,,15मौजूद हैं, कोई भी इन अत्यधिक केंद्रित स्टॉक उत्पन्न करने के लिए आवश्यक मजबूत प्रतिकृति का समर्थन नहीं करता है जो मानव नोरोवायरस/बैक्टीरियल इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए पीसीआर और प्रस्फुटन गिनती के उपयोग को प्रतिबंधित या समाप्त करता है ।
इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, वायरस जैसे कणों (वीएलपी) का उपयोग मानव नोरोवायरस और बैक्टीरिया16,,17के बीच बातचीत की जांच करने के लिए जी वायरस के लिए सरोगेट के रूप में किया जा सकता है। वीएलपी गैर-संक्रामक कण हैं जो वायरस के समान होते हैं जिनसे वे प्राप्त होते हैं। मानव नोरोवायरस के मामले में, ये कण वीवीपी1 (और कुछ समय वी2) प्रोटीन की अभिव्यक्ति से उत्पन्न होते हैं, जो आनुवंशिक सामग्री की कमी वाले बरकरार वायरल कैपसिड (यानी, नोरोवायरस के लिए आरएनए) बनाने के लिए स्वयं इकट्ठा होते हैं। इन वीएलपी को अच्छी तरह से चिह्नित किया गया है, संरचनात्मक रूप से और एंटीजनरूप से जंगली प्रकार के वायरस के समान होते हैं जिनसे वे18,,19,,20,,21,22,,23प्राप्त होते हैं।, इसलिए, वीएलपी मानव नोरोवायरस और कॉममेंसल बैक्टीरिया के बीच सतह बातचीत की जांच के लिए एक आदर्श किराए के रूप में काम करते हैं। यह देखते हुए कि वीएलपी में आनुवंशिक सामग्री की कमी है, पीसीआर आधारित परखों का उपयोग वायरल बाध्यकारी की मात्रा निर्धारित करने के लिए नहीं किया जा सकता है । एक एंटीबॉडी आधारित प्रवाह साइटोमेट्री विधि पहले वर्णित थी और अर्ध-मात्रात्मक तरीकेसेबैक्टीरिया के लिए वीएलपी बाध्यकारी के निम्न स्तर का पता लगाने में सक्षम थी। इस विधि को ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-सकारात्मक कॉमेसल बैक्टीरिया16दोनों के लिए बाध्यकारी मानव नोरोवायरस वीएलपी के सटीक मात्राकरण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरिया के लिए आंत्र वायरस के बाध्यकारी मात्रा निर्धारित करने की क्षमता तंत्र है जिसके द्वारा इन बैक्टीरिया वायरल संक्रमण को बदलने को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है । यह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सुटुका भर और चैनल मोस्बी-हंड्रप को लिखित पांडुलिपि की उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही अल्फोन्सो कैरिलो को बैक्टीरियल मानक घटता पैदा करने के साथ सहायता के लिए । यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21AI140012) से अनुदान और फ्लोरिडा विश्वविद्यालय, खाद्य और कृषि विज्ञान संस्थान से एक बीज अनुदान द्वारा भाग में वित्त पोषित है ।
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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