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Immunology and Infection

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all'interno della popolazione.

Abstract

I batteri commensale sono ben consolidati per influenzare l'infezione dei virus eucarioti. Il legame diretto tra l'agente patogeno e il microbioma ospite è responsabile dell'alterazione dell'infezione per molti di questi virus. Pertanto, caratterizzare la natura del legame virusbatterico è un passo fondamentale necessario per chiarire i meccanismi con cui i batteri alterano l'infezione virale. Per il norovirus umano, i batteri commensale migliorano l'infezione delle cellule B. Il virus si lega direttamente a questi batteri, indicando che questa interazione diretta è coinvolto nel meccanismo di miglioramento dell'infezione. Una varietà di tecniche può essere utilizzata per quantificare le interazioni tra batteri e virus, tra cui il conteggio scintillio dei virus radioetichettati e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Entrambi i metodi richiedono l'uso di virus dal vivo, che potrebbe essere necessario generare in laboratorio. Attualmente, nessuno dei sistemi di coltura in vitro già stabiliti per il norovirus umano è abbastanza robusto da consentire la generazione di scorte virali altamente concentrate. Al posto del virus vivo, particelle simili a virus (VLP) sono state utilizzate per caratterizzare le interazioni tra norovirus e batteri. Qui viene descritto un metodo di citometria a flusso con anticorpi specifici del virus per quantificare il legame VLP ai batteri gram-negativi e gram-positivi. L'inclusione solo dei batteri e i controlli dell'isotipo hanno permesso l'ottimizzazione del saggio per ridurre il legame degli anticorpi di fondo e la quantificazione accurata dell'attaccamento VLP ai batteri testati. Alti rapporti VLP:batterio si traducono in VLP che si legano a grandi percentuali della popolazione batterica. Tuttavia, quando le quantità di VLP sono diminuite, diminuisce anche la percentuale di batteri legati. In definitiva, questo metodo può essere impiegato in esperimenti futuri che chiariscono le condizioni specifiche e i componenti strutturali che regolano il norovirus: le interazioni batteriche.

Introduction

I norovirus umani (HuNoVs) sono la principale causa di malattie gastrointestinali in tutto il mondo, responsabili di 685 milioni di infezioni e oltre 200.000 decessi ogni anno1. Come con altri virus enterici, la presenza di batteri commensale è stato indicato per migliorare l'infezione di questo agente patogeno così come il suo virus surrogato, murine norovirus2,3. Ci sono anche rapporti contrastanti che i batteri possono inibire l'infezione da norovirus umano4,5,6. Per diversi virus, l'interazione diretta tra il virus e i batteri sembra essere alla base dei meccanismi che influiscono sull'infezione virale2,,7,8,9,10, ed è stata dimostrata attraverso la microscopia elettronica che i norovirus umani legano direttamente alle superfici dei batteri11,12. Pertanto, caratterizzare queste interazioni è diventato fondamentale per determinare i meccanismi con cui i batteri influenzano l'infezione virale. Questa caratterizzazione è classicamente iniziata con la quantificazione del legame virale a una serie di specie batteriche che sono componenti del microbioma ospite7,12,13. Questi test di attaccamento non solo rivelano la quantità di virus legato ai batteri, ma aiutano anche a determinare l'impatto di questa interazione sulla forma fisica e sulla sopravvivenza virali.

Per quantificare l'attaccamento virale, i metodi tradizionalmente impiegati includono saggi basati su PCR che quantificano i genomi virali12 o la generazione di virus radioetichettato e l'uso del conteggio scintillio per quantificare le particelle virali7,8,9,13. L'uso di questi metodi richiede generalmente l'accesso alle scorte di virus ad alto tè e alle tecniche di coltivazione in vitro con cui generarle. Mentre diversi sistemi di coltura per il norovirus umano esistono attualmente2,14,15, nessuno supporta la replica robusta necessaria per generare questi stock altamente concentrati che limita o elimina l'uso di PCR scintill e conteggio per quantificare le interazioni uomo norovirus/ batteriche.

Per aggirare questo problema, le particelle simili a virus (VLP) possono essere utilizzate come surrogato per vivere il virus per studiare le interazioni tra norovirus umano e batteri16,17. I VLP sono particelle non infettive che assomigliano molto al virus da cui sono derivate. Nel caso del norovirus umano, queste particelle sono generate dall'espressione della proteina VP1 (e a volte VP2), che si auto-assemblano per creare capsidi virali intatti privi di materiale genetico (cioè RNA per norovirus). Questi VLP sono stati ben caratterizzati, sono strutturalmente e antigenicamente simili ai virus wild-type da cui sono derivati18,19,20,21,22,23. Pertanto, i VLP fungono da surrogato ideale per studiare le interazioni superficiali tra norovirus umano e batteri commensale. Dato che i VLP non dispongono di materiale genetico, i saggi basati su PCR non possono essere utilizzati per quantificare il legame virale. Un metodo di citometria di flusso basato su anticorpi è stato descritto in precedenza e in grado di rilevare bassi livelli di legame VLP ai batteri in modo semi-quantitativo16. Questo metodo è stato ottimizzato per consentire una quantificazione accurata del legame VLP del norovirus umano sia ai batteri commensale gram-negativi che gram-positivi16.

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Protocol

NOTA: Le condizioni di crescita batterica delineate nel protocollo sono condizioni di coltura standard per Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Per eseguire il virus: i batteri attaccano il saggio con altre specie batteriche, i batteri scelti devono essere coltivati in condizioni standard appropriate per il batterio.

1. Preparazione di mezzo di crescita batterica

  1. Enterobacter cloacae crescita media
    1. Preparare il mezzo liquido sciogliendo 10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 1 L di acqua deionizzata (DI) (vedi Tabella dei materiali). Mescolare accuratamente tutti i media e sterilizzare autoclaving per 30 min.
    2. Preparare il mezzo solido sciogliendo 10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl e 15 g di agar in 1 L di acqua DI. Mescolare accuratamente tutti i media e sterilizzare autoclaving per 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri media di crescita
    1. Preparare il mezzo liquido sciogliendo 55 g di De Man, Rogosa e Sharpe (MRS; vedi Tabella dei materiali) polvere in 1 L di acqua DI. Utilizzare il supporto entro un mese dalla preparazione. Per sterilizzare, riscaldare il mezzo per 15 minuti fino a ebollizione seguita da autoclaving per 15 min.
    2. Preparare il mezzo solido sciogliendo 55 g di polvere MRS e 15 g di agar in 1 L di acqua DI. Per sterilizzare, riscaldare il mezzo per 15 minuti fino a ebollizione seguita da autoclaving per 15 min.

2. Stabilire una curva standard di correlazione ottica (OD) e la concentrazione batterica

  1. Inoculare 5 mL di mezzo liquido appropriato con una singola colonia isolata da una piastra di agar (E. cloacae) o direttamente da brodo di glicerolo congelato (L. gasseri).
  2. Coltivare il batterio durante la notte, in condizioni atmosferiche adeguate (Enterobacter cloacae: 37 gradi centigradi con agitazione aerobica a 200 giri/min; L. gasseri: bagno d'acqua di 37 gradi centigradi senza agitazione in un contenitore ermetico).
  3. Trasferire 2 x 1,3 mL di coltura durante la notte in due tubi di centrifuga di 1,5 ml separati e batteri centrifugati a 10.000 x g per 5 min.
  4. Rimuovere i campioni supernatali e lavati con 1 mL di sterile 1x fosfato tampinato salina (PBS). Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di 2 lavaggi.
  5. Centrifugare nuovamente i campioni a 10.000 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere in 1,3 mL di sterile 1x PBS.
  6. A partire da 0,5 mL di coltura lavata, diluire serialmente i batteri in 1x PBS da 10-1 a 10-4.
  7. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della coltura lavata e non diluita e ciascuna delle quattro diluizioni a 600 nm (OD600).
  8. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte in 1x PBS per ogni diluizione dal passaggio 2.6. Stendere la piastra 100 -L delle ultime 3 diluizioni per ogni serie su un mezzo solido appropriato per determinare il numero di unità di formazione colonia per millilifurer (CFU/mL) di ciascun campione. Piastra ogni diluizione in triplice copia.
  9. Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per 5 min. Invertire le piastre e incubare le condizioni atmosferiche appropriate (E. cloacae: aerobica a 37 gradi centigradi, incubare le piastre durante la notte; L. gasseri: anaerobica a 37 gradi centigradi, incubare piastre per 48 h in un contenitore ermetico con banchine d'aria aneroiche (vedi Tabella dei materiali)).
    NOTA: Utilizzare 1 sacca d'aria anaerobica per un barattolo da 2,5 L o una sacca da 7,0 L (vedere Tabella dei materiali).
  10. Utilizzare i conteggi delle placche per determinare CFU/mL per ciascuno dei 5 campioni (ad esempio, non diluiti, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Generare una curva standard confrontando OD600 e CFU/mL. L'equazione per questa linea verrà utilizzata nei saggi di attaccamento VLP-batteri per determinare CFU/mL in base all'OD600.

3. VLP-batteri Attacco Saggio

AVVISO: i VLP per il norovirus umano sono un pericolo per il livello di biosicurezza (BSL)-2 e tutto il lavoro che coinvolge i VLP deve essere eseguito in un armadietto della biosicurezza. La preparazione delle colture batteriche, prima del test di attaccamento, deve essere eseguita utilizzando condizioni di sicurezza appropriate per l'organismo.

  1. Preparazione del reagente
    1. 1x salina tampone da fosfato (PBS)
      1. Preparare 1 L di 10x PBS sciogliendo un intero pacchetto in 1 L di acqua DI.
      2. Soluzione autoclave per 30 min.
      3. Preparare una soluzione 1x diluindo la soluzione 1:10 di cui sopra in acqua DI.
      4. Filtrare sterilizzare la soluzione passando attraverso un filtro da 0,22 m e conservarlo a temperatura ambiente.
    2. 5% BSA
      1. Aggiungere 5 g di polvere di siero bovino (BSA) a 100 mL di PBS per generare una soluzione del 5% (w/v).
      2. Mescolare la soluzione vortice o su una piastra di mescolare utilizzando una barra di stiring di metallo fino a quando i grumi si sono sciolti.
      3. Filtrare sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
      4. Conservare la soluzione a 4 gradi centigradi.
    3. Buffer di macchie di citometria di flusso (FCSB)
      1. Filtro acquistato FCSB (vedi Tabella dei materiali)tramite un filtro da 0,22 m.
      2. Conservare la soluzione rimanente a 4 gradi centigradi.
    4. Buffer di blocco 5% (BB)
      NOTA: Preparare fresco ogni volta.
      1. Aggiungere 0,5 g di BSA a 10 mL di FCSB sterile.
      2. Vortice per mescolare completamente il campione e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.
  2. Coniugazione anticorpale
    1. Concatenare l'anticorpo GII norovirus umano (vedi Tabella dei materiali) con r-phycoerythrin (PE) utilizzando un kit di etichettatura anticorpo R-PE per le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    2. Conservare l'anticorpo coniugato al buio a 4 gradi centigradi per un uso futuro nell'analisi del saggio di attaccamento VLP-batterio.
      NOTA: L'anticorpo primario deve essere titolato prima dell'uso nel saggio di attaccamento VLP-batteri per determinare la giusta concentrazione necessaria per l'analisi della citometria del flusso. La titolazione degli anticorpi deve essere eseguita ogni volta che viene eseguita la reazione di coniugazione e per ogni batterio utilizzato nel saggio di attaccamento.
  3. Titorazione anticorpale
    1. Diluire l'anticorpo GII anti-umano coniugato norovirus 100 volte, con una diluizione iniziale di 1:100 e una diluizione finale di 1:600 (sei diluizioni in totale).
    2. Eseguire un saggio di allegato antivirus come descritto di seguito con la seguente eccezione: al passaggio 3.5.7 resospendere il pellet batterico in 350 : L del 5% BB.
    3. Dividere il campione in sette aliquote da 50 l.l.
    4. Aggiungere 50 l di ogni diluizione dell'anticorpo a un tubo.
    5. Aggiungere 50 -L di 5% BB al settimo tubo come controllo incontaminato.
    6. Eseguire la citometria di flusso su tutti i campioni come descritto di seguito.
    7. Confrontare i campioni di anticorpi diluiti con i controlli non macchiati e gli uni agli altri. La più bassa concentrazione di anticorpi che non comporta una diminuzione o perdita di segnale positivo deve essere scelta per l'uso nei saggi successivi.
  4. Preparazione di batteri
    1. Far crescere i batteri in 40 mL di mezzo liquido appropriato in condizioni atmosferiche appropriate fino a quando i batteri sono in fase stazionaria.
      1. Coltiva le colture E. cloacae in modo aerobico durante la notte a Luria Broth a 37 gradi centigradi, tremando a 200 giri/min per raggiungere una fase stazionaria.
      2. Coltiva le colture L. gasseri nel brodo MRS in tubi neri a vite senza agitare in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi centigradi per raggiungere la fase stazionaria.
    2. Trasferire colture di fase stazionarie per pulire tubi conici da 50 mL e centrifugare a 2.288 x g per 10 min a pellet i batteri.
    3. Rimuovere il supernatante e risospendere in 13 mL di sterile 1x PBS. Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di due lavaggi.
    4. Centrifugare nuovamente i campioni, rimuovere il supernatante e sospendere i campioni in 20 mL di 1x PBS.
      NOTA: Se il pellet cellulare è piccolo, il volume di sospensione può essere ridotto.
    5. Misurare l'OD600 della coltura.
    6. Utilizzando la curva standard precedentemente preparata, determinare la CFU per mL della coltura lavata.
    7. Diluire i batteri in base alle esigenze con 1x PBS per regolare la concentrazione di coltura a 1 x 108 CFU/mL.
    8. Trasferire 1 mL della coltura batterica 1 x 108 CFU/mL al numero richiesto di tubi di centrifuga di 1,5 mL.
    9. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per 5 min.
    10. Risospendere il pellet batterico in 1 mL di sterile 5% BSA.
    11. Incubare i tubi per 1 h a 37 gradi centigradi con rotazione costante.
  5. Allegato di virus
    1. Lavorando all'interno di un armadio di biosicurezza BSL-2, aggiungere 10 g di VLP HuNoV (vedi Tabella dei materiali) ad ogni tubo contenente batteri risospesi in PBS e mescolare accuratamente con il pipettaggio.
      NOTA: la concentrazione di VLP varia a seconda della preparazione VLP. Pertanto, il volume aggiunto ai batteri varierà tra i lotti di preparazione e deve essere regolato di conseguenza in modo che 10 g viene aggiunto a ogni tubo nell'esperimento. Per i controlli solo per i batteri (ad esempio, campioni senza VLP), aggiungere un volume di PBS che corrisponde al volume di VLP aggiunto ai campioni sperimentali.
    2. Incubare i tubi per 1 h a 37 gradi centigradi con rotazione costante.
      NOTA: Durante l'incubazione viene utilizzato un revolver a tubo (vedere Tabella dei materiali)impostato su 40 giri/min.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    4. Scartare il pellet batterico supernatante e resospende in 1 mL di PBS.
    5. Ripetere i passaggi di lavaggio 3.5.3 e 3.5.4.
    6. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    7. Scartare il pellet batterico supernatante e resospende il pellet batterico in 150 .
  6. Colorazione anticorpale
    1. Preparare fresco 5% BB.
      NOTA: Tutto il lavoro che utilizza l'anticorpo fluorescente etichettato deve essere eseguito al buio e l'anticorpo, BB e FCSB devono essere tenuti sul ghiaccio.
    2. Diluire l'anticorpo GII di norovirus umano 1:125 per i campioni di E. cloacae e 1:150 per campioni di L. gasseri nel 5% DI BB, preparando 50 l.l di anticorpi diluiti per ogni campione.
    3. Diluire l'anticorpo isotipo nello stesso modo in cui l'anticorpo GII norovirus umano è stato diluito per ogni batterio nel 5% BB, preparando 50 l di controllo isotipo diluito per campione.
    4. Dividere ogni campione di prova di fissaggio dal passo 3.3.7 in tre 50 ll trasferendoli in tubi di centrifuga puliti da 1,5 mL.
    5. Al primo set di campioni, aggiungere 50 l di BB. Questo set sarà il controllo unstained (Uns).
    6. Al secondo set, aggiungere 50 L della diluizione dell'anticorpo GII. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1:250 per E. cloacae e 1:300 per L. gasseri. Questo set di campioni sarà il campione colorato (AB).
    7. Al terzo set, aggiungere 50 l ofotipo diluito. Questo set sarà i controlli isotipi (IC). Mescolare bene pipettando. Incubare i campioni sul ghiaccio e al buio per 30 min.
    8. Centrifuga tutti i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    9. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i campioni in 100 gradi L di FCSB.
    10. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i campioni in 100 .
    11. Centrifuga tutti i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    12. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i campioni in 150 gradi l di FCSB.
    13. Trasferire ogni campione su un tubo FCSB contenente 400 l di tampone FCSB per un volume totale di 550 .
    14. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi fino a quando non vengono analizzati dalla citometria di flusso.
      NOTA: La citometria di flusso viene eseguita entro 4 h dalla colorazione degli anticorpi.

4. Citometria di flusso

NOTA: le impostazioni di tensione descritte di seguito si basano sul citometro di flusso e sul software elencato nella Tabella dei materiali e probabilmente variano a seconda dei citometri di flusso. Le impostazioni devono essere ottimizzate per ogni batterio. Assicurarsi che gli assi per tutti i grafici siano in fase biesponenziale.

  1. Configurazione dell'area di lavoro
    NOTA: la configurazione per i grafici utilizzati per stabilire l'area di lavoro è diversa da quella utilizzata per l'analisi e l'analisi dei dati. Lo scopo della configurazione dell'area di lavoro è quello di visualizzare la popolazione cellulare, garantire che non vi sia un agglomeramento eccessivo delle cellule batteriche che potrebbero influire sull'analisi a valle e distinguere tra cellule macchiate e non colorate durante la raccolta dei dati.
    1. Al fine di garantire che i batteri non si aggregano insieme, impostare una serie di appezzamenti di densità.
      1. Generare un'area di dispersione in avanti (FSC-A) e un'area di dispersione laterale (SSC-A) per visualizzare la popolazione totale.
      2. Impostare i grafici per valutare le singole celle rispetto ai grumi di celle creando due grafici che confrontano sia la larghezza della dispersione in avanti (FSC-W) che la larghezza della dispersione laterale (SSC-W) con l'avanti (FSC-H) e l'altezza della dispersione laterale (SSC-H).
      3. Creare un grafico che mostri solo la popolazione PE positiva (PE-A e SSC-A).
    2. Impostare la tensione di base su 500 per E. cloacae e 340 per L. gasseri. Questi saranno ulteriormente regolati in seguito.
    3. Impostare il numero totale di eventi conteggiati su 10.000 eventi.
  2. Esecuzione di esempi
    1. Creare tre grafici dell'istogramma separati che mostrano il conteggio tracciato rispetto a SSC-A, FSC-A o PE-A.
    2. Posizionare un campione non colorato sul citometro di flusso e acquisire gli eventi del campione, assicurando che il picco massimo sull'istogramma per SSC-A sia compreso tra 102 e 103 e che il picco massimo sull'istogramma per FSC-A sia compreso tra 104 e 105 sull'asse x. In caso contrario, i picchi non rientrano negli intervalli specificati, regolare di conseguenza le tensioni FSC e SSC.
    3. Posizionare un campione macchiato (AB) sul citometro di flusso e regolare la tensione PE per rendere il picco massimo oltre 103 sull'asse x.
    4. Sulla base di queste misurazioni, impostare il cancello PE positivo e impostare il cancello sul grafico di densità PE-A rispetto A SSC-A.
    5. Eseguire tutti i campioni con le impostazioni determinate a bassa o media velocità.

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Representative Results

Le strategie di gating utilizzate per quantificare il legame VLP del norovirus umano ai batteri commensale sono mostrate nella Figura 1. Il punto di densità rappresentativo fornisce una panoramica di come i campioni sono stati recintati per eliminare i detriti cellulari e gli ammassamenti di cellule in modo che l'attacco VLP sia stato determinato su popolazioni singlet(Figura 1A). Gli istogrammi rappresentativi dimostrano bassi livelli di segnale anticorpale anti-norovirus nei batteri solo campioni privi di VLP norovirus e basso segnale di fondo di campioni di VLP-batteri macchiati con l'anticorpo di controllo dell'isotipo (Figura 1B). I picchi di controllo dell'isotipo si sovrappongono anche a campioni incontaminati, mentre la colorazione degli stessi campioni con anticorpi GII anti-umano norovirus GII risultati in cambiamenti significativi nel picco.

Il metodo di sottrazione dell'istogramma Overton è stato utilizzato per confrontare il segnale PE-positivo nei campioni anticorpo GII anti-uomo norovirus macchiato al segnale PE-positivo del corrispondente controllo dell'isotipo e determinare la percentuale della popolazione batterica legata da VLP umano norovirus (Figura 1B). Dopo 1 h di incubazione con 10 g di VLP, la citometria a flusso ha rilevato il legame di particelle sia a E. cloacae che a L. gasseri (Figura 2). Infatti, alti livelli di legame si è verificato in queste condizioni per entrambi i batteri; l'associazione a L. gasseri si è verificata a livelli leggermente superiori, ma significativi (p < 0,0001), rispetto a E. cloacae. Questi saggi dimostrano che la citometria di flusso può essere utilizzata per rilevare il legame di norovirus umano sia ai batteri Gram-positivi che a i batteri Gram-negativi.

Per determinare il limite di quantificazione vincolante per questo saggio, è stata generata una serie di diluizione dei VLP prima dell'aggiunta ai batteri (Figura 3). Per entrambi i generi di batteri, riduzioni nella quantità di VLP aggiunto alla coltura batterica ha portato a corrispondenti riduzioni della percentuale di batteri legati da VLP. I cambiamenti nella percentuale di E. cloacae legati dalla particella erano più graduali rispetto a L. gasseri, ma l'attaccamento percentuale per entrambi i batteri si è livellato nonostante ulteriori riduzioni della concentrazione di VLP. In particolare, 0,1 g o meno (dati non mostrati) di VLP in 108 CFU di batteri ha provocato un aumento della media di attaccamento percentuale tra il 13-19% per entrambi i batteri, il che indica che questa percentuale è il limite di quantificazione per questo saggio.

Figure 1
Figura 1: Analisi citometrica del flusso rappresentativo dell'associazione VLP del norovirus umano. (A) Strategia rappresentativa di citometria di flusso per quantificare il legame VLP ai batteri. I complotti di densità sono stati utilizzati per eliminare i detriti cellulari, seguiti da successivi lotti a punti per rimuovere doppietti batterici e grumi cellulari. (B) Gli istogrammi rappresentativi dimostrano una mancanza di segnale PE nei campioni solo batterici e uno spostamento dell'intensità del segnale PE nei campioni di VLP:bacterio rispetto ai controlli incontaminati e isotipi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: fissaggio VLP a E. cloacae e L. gasseri. Le colture notturne di E. cloacae (n ) e L. gasseri (n ) sono state diluite a 1 x 108 CFU/mL in PBS. I batteri sono stati incubati con 10 g di VLP GII.4 per 1 h, quindi l'attaccamento VLP è stato misurato usando la citometria di flusso. Un grafico rappresentativo è disponibile nella Figura 1B. L'attacco percentuale è stato determinato utilizzando il metodo di sottrazione dell'istogramma Overton confrontando il segnale PE-positivo dei campioni macchiati di Norovirus umano GII con il segnale PE-positivo del corrispondente controllo dell'isotipo. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t di Student non accoppiato (p < 0.0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: serie di diluizione VLP per E. cloacae e L. gasseri. Il numero di VLP GII.4 è stato diluito in serie e le diluizioni VLP sono state aggiunte ciascuna a 1 x 108 batteri in un volume finale di 1 mL (n x 3 per entrambi i batteri). I campioni sono stati incubati per un'ora a 37 gradi centigradi. L'attaccamento VLP ai batteri è stato misurato utilizzando la citometria di flusso. L'attacco percentuale è stato determinato utilizzando il metodo di sottrazione dell'istogramma Overton confrontando il segnale PE-positivo dei campioni macchiati di Norovirus umano GII con il segnale PE-positivo del corrispondente controllo dell'isotipo. La riduzione delle quantità di ingresso di VLP ha comportato una riduzione graduale del collegamento percentuale sia per(A) E. cloacae che per (B) L. gasseri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La capacità di quantificare il legame dei virus enterici ai batteri è un primo passo fondamentale per chiarire i meccanismi con cui questi batteri alterano l'infezione virale. I metodi qui descritti sono stati ottimizzati per misurare le interazioni VLP del norovirus umano sia con E. cloacae (batterio gram-negativo) che con L. gasseri (un batterio gram-positivo), ma possono essere adattati per l'uso con qualsiasi virus dei mammiferi e batterio di interesse. Mentre i VLP sono un'alternativa ideale al virus vivo per l'uso nei saggi di attaccamento e queste particelle possono essere facilmente quantificate utilizzando la citometria di flusso, le particelle P sono state utilizzate anche per esaminare le interazioni tra norovirus umani e batteri24. In questo studio, la quantità di virus legata ai batteri è stata quantificata in contrasto con la popolazione batterica, come riportato qui. Le particelle di P offrono un vantaggio rispetto ai VLP in quanto sono più facili da produrre, fornendo allo stesso tempo una somiglianza antigenica sia ai VLP che al virus wild-type24,25. Tuttavia, i VLP per il norovirus umano sono disponibili in commercio fornendo un mezzo per i laboratori privi della capacità di generare VLP o particelle P. Le particelle di P differiscono dai VLP in quanto, mentre i VLP mantengono le dimensioni di una particella virale di tipo selvaggio, le particelle P sono più piccole e hanno simmetria tetraedrica piuttosto che icosaedrica25. L'impatto di queste caratteristiche sulle interazioni con i batteri non è stato esplorato e le particelle P possono servire come alternativa praticabile ai VLP per caratterizzare le interazioni superficiali tra norovirus umano e batteri.

Come accennato in precedenza, l'analisi descritta sopra può essere utilizzata per caratterizzare ulteriormente le interazioni tra VLP e batteri del norovirus umano. Le indagini su come le condizioni di crescita e i cambiamenti nell'espressione della struttura superficiale batterica alterano il legame virale può essere esplorato utilizzando questa tecnica. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato anche per determinare specifiche strutture batteriche legate dal virus attraverso analisi di inibizione competitive utilizzando proteine batteriche o glicani, trattamento enzimatico per rimuovere specifiche strutture superficiali, o incubazione con ceppi batterici mutanti carenti in particolare una struttura. Questo saggio può anche essere impiegato per studiare la capacità di altri ceppi di norovirus di interagire con i batteri commensale.

Poiché questo analisi quantifica la proporzione della popolazione batterica legata dal norovirus VLP, è fondamentale determinare con precisione la correlazione tra CFU/mL e OD600 in modo da misurare la concentrazione della coltura batterica. Le fluttuazioni nel rapporto VLP:batteri alterano la percentuale della popolazione di batteri vincolata dai VLP e possono portare alla variabilità nei risultati. Occorre inoltre prestare attenzione ad aggiungere quantità sufficienti di particelle virali, poiché il limite di rilevazione di questo saggio si avvicina a 0,1 g di VLP/108 CFU di batteri. I rapporti al di sotto di questo limite hanno prodotto costantemente valori di attacco percentuale del 13-19%; quindi l'attaccamento della popolazione osservato a o al di sotto di queste percentuali potrebbe non essere reale.

Sono state eseguite titrazioni di anticorpi per ogni anticorpo appena coniugato e contro ogni ceppo batterico prima dell'uso negli esperimenti di fissaggio VLP:bacteria. Le concentrazioni di anticorpi richieste per ogni batterio erano simili da 1:250 per E. cloacae e 1:300 per L. gasseri. Le piccole dimensioni dei batteri, rispetto alle dimensioni delle cellule eucariotiche, richiedono sia la regolazione della tensione che l'uso di una distribuzione binomiale durante la raccolta dei dati per separare adeguatamente i batteri dai detriti che possono essere trovati nei campioni o che circolano all'interno dello strumento. Dopo la raccolta dei dati, è possibile utilizzare una corretta gating per rimuovere ulteriormente le particelle di detriti più grandi e i grumi batterici in modo da analizzare solo le popolazioni di singole cellule. È anche fondamentale stabilire impostazioni di tensione uniche per ogni specie batterica testata poiché queste fluttuano ampiamente, in particolare tra i batteri gram-negativi e gram-positivi.

Anche l'inclusione di controlli adeguati, compresi i batteri, i controlli solo batterici e isotipi sono fondamentali per un'analisi accurata dei dati. Entrambi i tipi di controlli informano per quanto riguarda i livelli di rilegatura anticorpale non specifica. I nostri risultati dimostrano che gli anticorpi utilizzati per non legarsi specificamente alle specie batteriche testate, ma il legame non specifico potrebbe cambiare con cambiamenti nelle specie batteriche o negli anticorpi.

Il metodo qui presentato quantifica il legame delle particelle di norovirus umano sia ai batteri gram-positivi che gram-negativi ed è utile per caratterizzare le interazioni virus:batteriche. Inoltre, questo protocollo di base può essere facilmente ottimizzato per l'uso con altri genotipi di norovirus umano, così come altri virus e batteri dei mammiferi.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup per la loro revisione critica del manoscritto scritto, così come Alfonso Carrillo per l'assistenza nella generazione di curve standard batteriche. Questo lavoro è finanziato in parte da una sovvenzione del National Institute of Health (R21AI140012) e da una sovvenzione di seme dell'Università della Florida, Istituto di Scienze dell'Alimentazione e dell'Agricoltura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

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Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso
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Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

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