Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental
Summary
Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.
Abstract
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central (SNC) causada por la combinación de factores ambientales y antecedentes genéticos susceptibles. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad típico de la EME ampliamente utilizado para investigar la patogénesis en la que los linfocitos T específicos para los antígenos de mielina inician una reacción inflamatoria en el SNC. Es muy importante evaluar cómo los linfocitos en el SNC regulan el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, el enfoque para medir la cantidad y calidad de los linfocitos infiltrados en el SNC es muy limitado debido a las dificultades para aislar y detectar linfocitos infiltrados del cerebro. Este manuscrito presenta un protocolo para el cual es útil para el aislamiento, identificación y caracterización de linfocitos infiltrados del SNC y será útil para nuestra comprensión de cómo los linfocitos están involucrados en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.
Introduction
Como enfermedad desmielinizante crónica del SNC, la SME afecta a unos 2,5 millones de personas en todo el mundo y carece de tratamientos curativos1. También se considera una enfermedad autoinmune, en la que los linfocitos T específicos del antígeno de mielina inician una reacción inflamatoria y conducen a la desmielinización y lesión axonal en el SNC2. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) se ha utilizado ampliamente para investigar mecanismos patógenos de la EME como un modelo clásico de la enfermedad de desmielinización autoinmune en el SNC3. Hay dos maneras de inducir EAE: una es inducir EAE activamente inmunizando animales con componentes de mielina, otra es la transferencia adoptiva mediante la transferencia de células T encefalitgénicas al receptor2,4,5. Las susceptibilidades a EAE son diferentes en diferentes cepas animales6. En ratones C57BL/6, el desafío de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) 35–55 induce una enfermedad monofásica con desmielinización e inflamación extensas en el SNC, que se utiliza con frecuencia en experimentos con ratones dirigidos a genes7.
La generación de células T reactivas específicas de mielina es necesaria para la aparición y el desarrollo de la enfermedad en EAE y es un signo inmunológico de EAE y MS. Los linfocitos T autoreactivos activados cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) hacia el SNC sano e inician la enfermedad de EAE. Cuando se encuentra MOG 35–55 Ag, estos linfocitos T inducen inflamación y el reclutamiento de células efectores en el SNC, lo que resulta en desmielinización y destrucción de axones8,,9. En el modelo EAE, hay una amplia evidencia de que las células CD4+ T específicas de neuroantigen pueden iniciar y sostener la neuroinflamación y la patología3,,10. Dependiendo de las principales citoquinas producidas, los linfocitos CD4+ T se han clasificado en diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado por la producción de interferón-γ), Th2 (caracterizado por la producción de interleucina 4), y Th17 (caracterizado por la producción de interleucina 17). Se cree que la activación de las células Th1 y Th17 contribuyen a la inducción, mantenimiento y regulación de la desmielinización inflamatoria en EAE y EM mediante el secretamiento de las citoquinas efectoras IFN-γ e IL-17, que son capaces de activar macrófagos y reclutar neutrófilos a los sitios inflamatorios para acelerar las lesiones11.
Debido a que las células T autorreactivas cruzan el BBB hacia el SNC e inducen el desarrollo de la enfermedad en la EMA y eas, es muy importante analizar las células T en el SNC. Sin embargo, hay muy pocos protocolos establecidos para el aislamiento de linfocitos del SNC12. Por lo tanto, se desarrolló un método optimizado para aislar células mononucleares del cerebro y analizar linfocitos T con marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para la citometría de flujo. El método utiliza la solución de trabajo Mycobacterium tuberculosis de toxinas de perersis (PTX) adyuvante MOG35–55 para inducir un modelo de inmunización activa de EAE en ratones. Luego, los métodos de separación mecánica y centrifugación de gradiente de densidad se utilizan para el aislamiento de células mononucleares del SNC. Por último, se utiliza una estrategia de medición de citometría de flujo optimizada para identificar linfocitos T y subconjuntos del cerebro mediante la tinción de múltiples marcadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio presenta un protocolo para inducir y monitorear EAE utilizando MOG35-55 en ratones C57BL/6, que se consideran un modelo animal experimental neuroinmunológico típico de MS. EAE se puede inducir variando las cepas de ratones o el tipo de proteína utilizada para la inducción de acuerdo con el propósito del estudio. Por ejemplo, el uso de péptido PLP139–151 en ratones SJL puede inducir un curso de enfermedad eaE recurrente-remitante que es especialmente adecuado para evaluar los efectos terapéuticos en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31570921 a ZJ, 81571533 a LS), la Comisión Municipal de Salud de Shanghái y la Planificación Familiar (201540206 a ZJ), la beca de investigación Ruijin Hospital North (2017ZX01 a ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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