Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit
Summary
Detta manuskript presenterar ett protokoll för att inducera aktiva experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) i möss. En metod för isolering och karakterisering av de infiltrerade lymfocyterna i centrala nervsystemet (CNS) presenteras också för att visa hur lymfocyter är involverade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.
Abstract
Multipel skleros (MS) är en autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som orsakas av kombinationen av miljöfaktorer och mottaglig genetisk bakgrund. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en typisk sjukdom modell av MS används allmänt för att undersöka patogenesen i vilka T-lymfocyter specifika för myelin antigener initiera en inflammatorisk reaktion i CNS. Det är mycket viktigt att bedöma hur lymfocyter i CNS reglerar utvecklingen av sjukdom. Men tillvägagångssättet för att mäta kvantitet och kvalitet av infiltrerade lymfocyter i CNS är mycket begränsad på grund av svårigheterna att isolera och upptäcka infiltrerade lymfocyter från hjärnan. Detta manuskript presenterar ett protokoll för som är användbart för isolering, identifiering och karakterisering av infiltrerade lymfocyter från CNS och kommer att vara till hjälp för vår förståelse av hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.
Introduction
Som en kronisk demyelinating sjukdom i CNS, MS drabbar cirka 2,5 miljoner människor över hela världen och saknar botande behandlingar1. Det anses också vara en autoimmun sjukdom, där myelin antigen specifika T-lymfocyter initiera en inflammatorisk reaktion och leda till demyelination och axonal skada i CNS2. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i stor utsträckning för att undersöka patogena mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelination sjukdom modell i CNS3. Det finns två sätt att inducera EAE: ett är att inducera EAE aktivt genom att immunisera djur med myelinkomponenter, en annan är adoptivöverföring genom att överföra encefalitogena T-celler till receptor2,4,5. Mottagligheterna för EAE är olika i olika djurstammar6. Hos C57BL/6-möss inducerar myelinoligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35–55-utmaning en monofasisk sjukdom med omfattande demyelination och inflammation i CNS, som ofta används i försök med geninriktade möss7.
Genereringen av myelinspecifika reaktiva T-celler krävs för förekomst och utveckling av sjukdom i EAE och är ett immunologiskt tecken på både EAE och MS. Aktiverade autoreaktiva T-lymfocyter korsar blodhjärnbarriären (BBB) i den friska CNS och initierar EAE-sjukdomen. När MOG 35–55 Ag påträffas framkallar dessa T-lymfocyter inflammation och rekrytering av effektorceller till CNS, vilket resulterar i demyelination och axonförstörelse8,9. I EAE-modellen finns det gott om bevis för att neuroantigenspecifika CD4+ T-celler kan initiera och upprätthålla neuroinflammation och patologi3,10. Beroende på de stora cytokiner som produceras, CD4+ T-lymfocyter har klassificerats i olika delmängder: Th1 (kännetecknas av produktion av interferon-γ), Th2 (kännetecknas av produktion av interleukin 4), och Th17 (kännetecknas av produktion av interleukin 17). Man tror att aktivering av Th1 och Th17 celler bidrar till induktion, underhåll, och reglering av inflammatorisk demyelination i EAE och MS genom att utsöndra effektor cytokiner IFN-γ och IL-17, som är i stånd att aktivera makrofager och rekrytera neutrofiler till de inflammatoriska platserna för att påskynda de skador11.
Eftersom autoreaktiva T-celler korsar BBB i CNS och inducerar utvecklingen av sjukdom i MS och EAE, är det mycket viktigt att analysera T-celler i CNS. Det finns dock mycket få etablerade protokoll för isolering av lymfocyter från CNS12. Därför utvecklades en metod som är optimerad för att isolera mononukleära celler från hjärnan och analysera T-lymfocyter med markörerna CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g och IL-17 för flödescytometri. Metoden använder MOG35– 55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra och Pertussis Toxin Working Solution (PTX) för att inducera en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos möss. Därefter används mekaniska separations- och densitetsgradientcentrifugationsmetoder för isolering av CNS mononukleära celler. Slutligen används en optimerad flödescytometri gating strategi för att identifiera T-lymfocyter och delmängder från hjärnan genom färgning av flera markörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie presenterar ett protokoll för att inducera och övervaka EAE med hjälp av MOG35-55 i C57BL/6 möss, som anses vara en typisk neuroimmunological experimentella djur modell av MS. EAE kan induceras varierande möss stammar eller vilken typ av protein som används för induktion enligt syftet med studien. Till exempel, med hjälp av PLP139–151 peptid i SJL möss kan framkalla en skovledslöpande EAE sjukdomsförloppet som är särskilt väl lämpad för att bedöma terapeutiska effekter på skov<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China grant (31570921 till ZJ, 81571533 till LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 till ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 till ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
